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目的:糖尿病骨骼肌病变是糖尿病的并发症之一,脂肪酸代谢紊乱是糖尿病骨骼肌病变的重要影响因素。研究糖尿病状态下骨骼肌的各种病理改变及脂肪酸代谢相关基因表达的变化,将有助于对糖尿病骨骼肌代谢紊乱的认识,对糖尿病骨骼肌病的防治具有重要的理论和实践意义,并有助于寻求防治糖尿病的有效对策。
在正常骨骼肌细胞中,脂肪酸在线粒体和过氧化物酶体中经β氧化途径进行氧化,线粒体中脂肪酸氧化的肌型-肉毒碱脂酰转移酶I(musele-carnitine palmitoyl-transferase I,M-CPT I)、脂酰辅酶A氧化酶(acyl-CoAoxidase,ACOX)分别是两途径的限速酶,过氧化物酶体脂肪酸β氧化除了ACOX外,还涉及L-双功能蛋白(L-bifunctional protein,LBP)和D-双功能蛋白(D-bifunctional protein,DBP)。健康人群空腹血浆FFA浓度波动在0.1-0.5mmol/L之间,反映了机体不同组织对FFA的摄取和释放之间的平衡,如脂肪组织及肝脏对FFA的再酯化以及骨骼肌、心肌等组织对FFA的氧化利用。糖尿病时,由于胰岛素绝对或相对缺乏使心肌对葡萄糖摄取、利用受损,而脂肪动员增强,血中脂肪酸水平升高,实验研究显示,大鼠糖尿病时心肌甘油三酯水解增强,造成心肌脂肪酸增多,那么,小鼠糖尿病时骨骼肌中脂肪酸的含量有何变化,未见报道。在链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠的心肌细胞中,PPARα、线粒体脂肪酸氧化的限速酶M-CPT I和过氧化物酶体脂肪酸氧化的限速酶.ACOXmRNA水平及DBP、LBP表达均增加,在骨骼肌中,脂酰CoA氧化酶基因表达增强,表明,糖尿病时脂肪酸氧化增强与线粒体、过氧化物酶体脂肪酸氧化增强有关。那么,糖尿病时,骨骼肌细胞线粒体脂肪酸氧化的限速酶M-CPT I、过氧化物酶体中与脂肪酸氧化的有关的另两种酶DBP、LBP表达如何,未见报道。在糖尿病时,大鼠心肌细胞的结构发生病变,骨骼肌细胞有何病理改变,未见报道。糖尿病时血浆及骨骼肌中FFA普遍升高,临床上广泛用于高脂血症治疗的辛伐他汀(Simvastatin),是胆固醇合成途径中限速酶HMGCoA还原酶的抑制剂,使胆固醇和低密度脂蛋白水平显著降低,有研究显示,辛伐他汀还可以降低甘油三酯及FFA水平,调节脂代谢。那么,糖尿病状态下,它对血浆及骨骼肌中FFA的浓度是否有影响?未见报道。给药后与骨骼肌脂肪酸氧化相关基因M-CPT I、DBP、LBP的表达有无变化,未见报道。
本实验用STZ破坏小鼠胰岛的β细胞,建立实验性糖尿病小鼠模型,检测正常小鼠和糖尿病小鼠血浆及骨骼肌中FFA的变化,观察糖尿病状态下骨骼肌细胞形态学的改变,检测糖尿病状态下骨骼肌细胞线粒体、过氧化物酶体中M-CPT I、DBP、LBP的表达情况;另外,检测给予降脂药辛伐他汀后,血浆及骨骼肌中FFA的变化情况以及与骨骼肌脂肪酸氧化相关基因M-CPT I、DBP、LBP的变化情况,为进一步探讨糖尿病骨骼肌脂代谢紊乱的分子机理提供实验依据。
方法:
1.实验动物分组及取材将成年雄性昆明小鼠适应性喂养一周后(体重30-50g),随机分为正常对照组20只(A组),STZ注射组50只(D组)。禁食12h后,糖尿病组小鼠一次性腹腔注射2%STZ(STZ临用前用0.1M、pH4.5柠檬酸钠缓冲液配制)150mg/kg,正常对照组小鼠腹腔注射等量柠檬酸钠缓冲液。注射后一周,眼眶静脉丛采血,测定禁食12h后STZ组的空腹血糖,血糖浓度大于11.1mmol/L的小鼠定为糖尿病小鼠。糖尿病小鼠在成功造模后8周末,一部分给予辛伐他汀片(用生理盐水溶解)13mg/kg/day灌胃(用药组,C组),连续两周,一部分为糖尿病对照组(B组),于10周末给予实验处理。实验动物处理前禁食12h,次日腹腔内注射10%水合氯醛(0.37g/kg)进行麻醉,眼眶静脉丛采血,分离血清用于血糖、血液FFA的测定;剪开腹部,,取下肢骨,剥离肌肉,用4℃预冷生理盐水冲洗,滤纸吸干,取一部分骨骼肌组织,固定于4%多聚甲醛溶液中,用于脏染色,光镜检测。其余组织立即置于液氮中,然后于-70℃保存,用于总RNA的提取及肌肉中FFA的测定。
2.血糖的测定采用葡萄糖氧化酶法试剂盒进行血糖的测定。
3.血液及骨骼肌细胞中FFA的测定利用化学法游离脂肪酸试剂盒进行FFA的测定。
4 光镜检测骨骼肌细胞形态学的变化取部分骨骼肌组织,固定于4%多聚甲醛溶液中,石蜡包埋、切片、HE染色,光镜观察骨骼肌细胞形态学改变。
5 mRNA表达的测定用Trigol法提取骨骼肌组织总RNA,以GAPDH作为内参照,RT-PCR法测定骨骼肌M-CPT I、DBP、LBP mPNA的相对表达量。
6 数据处理
所有数据均用x±s表示,采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,组间比较用单因素方差分析检验,检验以P<0.05为差异有显著性意义。
结论:
1.糖尿病时,骨骼肌中脂肪酸含量升高,脂肪酸代谢增强,骨骼肌细胞结构发生病理。
2.糖尿病时,骨骼肌脂肪酸氧化的增强不仅与M-CPT I mRNA的表达增加导致线粒体脂肪氧化增强有关,还与DBP、LBPmRNA表达增加导致的过氧化物酶体脂肪酸氧化增强有关。
3.辛伐他汀可以降低STZ诱导的糖尿病小鼠血浆及骨骼肌中脂肪酸的含量,但对骨骼肌脂肪酸代谢相关基因M-CPT I、DBP、LBP mRNA的表达没有影响。