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肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157:H7是一种食源性病原菌,能够引起出血性腹泻(HC),甚至溶血性尿毒综合征(HUS)等危及生命的疾病。大部分的临床分离菌株都含有一个约92kb的致病性大质粒pO157, pO157在EHEC O157:H7致病中的作用仍不十分清楚。在本研究中,我们通过比较EHEC O157:H7野生株EDL933和其大质粒缺失菌株ΔpO157在体外粘附能力、抗吞噬能力、对人外周血单个核细胞(PBMC)和巨噬细胞毒性作用、刺激人PBMC和巨噬细胞生成细胞因子方面,来探索大质粒在EHEC O157:H7致病过程中的作用。结果显示,在体外粘附实验中,ΔpO157对上皮细胞的粘附能力弱于野生株。利用乳酸脱氢酶(LDH)释放实验和细胞脱落实验,我们发现ΔPO157对人PBMC和巨噬细胞毒性作用显著低于野生株。同时我们检测了这两株细菌刺激人PBMC和巨噬细胞生成的细胞因子,发现野生株刺激PBMC生成白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的生成水平远远高于大质粒缺失株Δp0157；野生株和缺失株均不能刺激人巨噬细胞生成IL-6和IL-10,能生成TNF-a、IL-8、MCP-1、RANETS和IL-1β。其中只有IL-1β的水平在二者之间存在显著差异,野生株刺激IL-1β的生成水平远远高于大质粒缺失株Ap0157。提示大质粒在粘附、致PBMC和巨噬细胞毒性作用、刺激PBMC和巨噬细胞生成细胞因子方面起到了重要的作用。为了进一步探索大质粒上的哪些基因造成了野生株和大质粒缺失株之间的细胞毒和细胞因子差异,我们用一步缺失法构建了大质粒上的溶血素A基因的缺失菌株ΔhlyA和丝氨酸蛋白酶基因缺失菌株ΔespP进行上述实验。结果显示AespP与野生株在对细胞毒性作用和刺激细胞因子生成方面差异均无统计学意义。而AhlyA的细胞毒性显著低于野生株,但同Δp0157之间差异无统计学意义,同时AhlyA刺激人巨噬细胞生成IL-1B的水平远远低于野生株,高于Δp0157,提示溶血素是致人巨噬细胞产生细胞毒和IL-1B的重要原因。枸橼酸杆菌是重要的人类机会致病菌,存在于土壤、水体、食物以及人类和动物的肠道中。枸橼酸杆菌感染两个重要的途径是医院获得性感染和社区性感染,菌株分型在流行病学调查中有着很重要的作用。脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)是目前使用最广泛的病原菌分子分型方法。本研究目的是优化和建立用于枸橼酸分型的PFGE实验方案。我们首选对适合枸橼酸杆菌的限制性内切酶进行了选择,从7种内切酶中挑选XbaⅠ和BlnⅠ为内切酶,并且确定了电泳参数为1s—20 s,19h。随后,我们对胶块制备过程中的菌悬液浓度(2.5—3.5浊度)、SDS的使用(不需要使用SDS)和菌细胞裂解时间(1h)进行了优化。同时,我们对其分辨力、分型力和重复性进行了评价。结果显示,两种内切酶进行分型均具有很好的分型力和重复性；BlnⅠ-PFGE具有比XbaⅠ-PFGE更高的分辨力,所以我们推荐以BlnⅠ为首选内切酶,XbaⅠ为备选内切酶。