黄曲霉毒素具抑制免疫和致畸致癌致突变的作用,严重威胁着人类和动物的健康。饲料中的黄曲霉毒素主要由产毒黄曲霉生长代谢产生,抑制黄曲霉孢子生长萌发是预防饲料黄曲霉毒素污染的有效途径。探明黄曲霉孢子萌发过程中的代谢规律及调控途径,对科学抑制黄曲霉孢子萌发、生长并进而预防黄曲霉毒素污染有重要理论意义。本研究观察了黄曲霉孢子在萌发过程不同阶段的形态学变化,采用高通量测序、代谢组学等现代生物学技术,研究孢子萌发过程中的关键代谢通路以及基因,探明黄曲霉孢子萌发过程中的生物学机制,并探索了通过外源物质控制黄曲霉孢子萌发的可行性与机制,研究结果可为饲料黄曲霉毒素污染防控技术提供科学依据。主要研究工作如下:1.黄曲霉孢子萌发过程中的形态学变化本试验通过在察氏培养基中接种黄曲霉孢子,测定了黄曲霉孢子在培养0、2、4、6、8、10、12 h时的萌发率,观察了其在萌发过程中的形态学变化。结果如下:1)黄曲霉孢子萌发率随着培养时间呈现指数增加。黄曲霉孢子在培养6 h时开始出现萌发,平均萌发率为1.86%;从8 h到12 h,萌发率显著升高,8 h、10 h、12 h的萌发率分别为16.19%、49.16%和85.83%。说明黄曲霉孢子的萌发是一个渐进过程,受到培养时间控制。2)黄曲霉孢子在萌发的各阶段有着不同的形态特征。休眠阶段的孢子具有多层褶皱的细胞壁结构,具有抵抗外界极端环境的特征;孢子开始萌发后,细胞壁逐渐光滑、细胞内液泡增多变大,并形成水的连续相,为营养物质的溶解、转运及生化反应提供基础环境;孢子萌发中后期,细胞开始分裂产生芽管,逐步形成菌丝,完成萌发。2.黄曲霉孢子萌发过程关键代谢通路分析选择在察氏培养基中培养0 h、4 h、8 h、12 h的黄曲霉孢子作为试验材料,利用转录组学与代谢组学研究黄曲霉孢子在不同萌发阶段的典型代谢特征以及关键代谢通路。试验结果如下:1)转录组学结果显示,不同萌发阶段差异基因具有各自显著的特征。孢子在萌发初期由休眠状态进入活跃状态,呼吸作用增强、能量代谢加剧,开始合成氨基酸、脂质等物质,此阶段前后差异基因数量最多;萌发中期,黄曲霉孢子开始分裂,差异基因主要为营养物质转运相关基因;萌发后期与中期类似,差异基因与营养物质转运相关,并且次级代谢相关基因表达量持续上调。2)代谢组学结果显示,不同萌发阶段代谢产物各不相同。在孢子萌发初期,主要为不同糖的差异,最大差异产物为果糖、葡萄糖、松三糖;在萌发中期,主要为有机酸和酚酸的变化,最大差异产物为3,4-二羟基苯乙酸、硫胺素和2-羟基-4-甲基戊酸;在孢子萌发后期,主要为有机酸和脂质的变化,最大差异产物为磷酸甘油醛、溶血磷脂酰胆碱、2-羟基乙基膦酸。3)转录组学与代谢组学联合分析显示,在黄曲霉孢子萌发初期,主要为氨基酸合成和能量代谢,差异代谢物和差异基因主要富集的通路为氨基糖和核苷酸代谢、淀粉与蔗糖代谢;在孢子萌发中期,主要为能量代谢的不同,主要富集通路为戊糖和葡萄糖醛酸代谢;在萌发后期,主要为能量代谢的不同,主要富集的通路为碳代谢、糖酵解过程、磷酸戊糖代谢和丙酮酸代谢。3.黄曲霉孢子萌发过程中的碳代谢与氮代谢本试验在转录组学与代谢组学的基础上,对黄曲霉孢子在萌发过程中碳代谢相关基因与氮代谢相关基因进行进一步研究。通过在培养基中添加不同碳源以及氮源,观察野生型以及突变体菌株萌发率以及相关代谢基因的影响。结果如下:1)黄曲霉孢子萌发过程中,对于不同的碳源利用具有选择性。在培养过程中,蔗糖与海藻糖作为唯一碳源时,通过提高多聚糖合成酶基因的表达,相较果糖与葡萄糖显著促进了黄曲霉孢子的萌发,但果糖与葡萄糖可以显著增大萌发过程中孢子的细胞体积。2)黄曲霉孢子在萌发过程中氮代谢相关基因变化显著,MepA、MeaA、CrnA、NiiA、NiaD基因均在萌发初期显著增加,但在中后期并无显著变化。对黄曲霉的MepA与MeaA基因进行敲除,获得了突变体ΔMepA,但ΔMeaA突变体致死。在不同的氮源中硝酸盐更适合黄曲霉孢子萌发,ΔMepA孢子萌发率相较野生型均显著下降,且不受氮源种类影响。在萌发过程中,ΔMepA中的MeaA基因表达量显著上调,其他氮代谢基因无显著差异,结果表明MepA与MeaA共同发挥着转运铵离子的作用,其中MeaA发挥更重要的作用。4.外源物质对孢子萌发的影响及机制本试验选取对香豆酸与香叶醇两种植物精油作为外源添加剂,研究其对黄曲霉孢子萌发及关键代谢通路的影响。试验结果如下:对香豆酸与香叶醇对黄曲霉孢子萌发都有一定的抑制作用,200 mg/L的对香豆酸与100 mg/L的香叶醇抑制效果较好;对香豆酸与香叶醇在培养8 h时显著减少了孢子的体积;植物精油处理组ROS含量与氧化还原酶的活性均显著增加;而在氮代谢相关基因中,植物精油组MepA与MeaA基因表达量显著下调,NiiA、NiaD基因表达量显著上调。说明植物精油通过影响黄曲霉孢子萌发过程中氮代谢相关基因以及氧化还原过程,可以显著的抑制黄曲霉孢子萌发。综合上述试验结果,本研究得出以下结论:1)黄曲霉孢子的萌发具有时间相依性,不同的萌发阶段具有不同的形态特征。在萌发过程中,黄曲霉孢子吸水膨胀,形成水的连续相启动萌发过程,并逐步经历细胞分裂完成孢子萌发。2)黄曲霉孢子在萌发的不同阶段有着不同的代谢特征,尤以萌发初期代谢变化最为剧烈。孢子萌发初期,蛋白质的合成和呼吸作用在孢子萌发的起始阶段发挥了重要作用,在孢子萌发的中后期,能量代谢的方式开始多样化,并伴随着次级代谢产物的合成。3)黄曲霉孢子在萌发过程中对不同的碳源利用具有选择性,蔗糖与海藻糖,通过促进多糖合成基因的表达,更加适合孢子的萌发;对于氮源同样具有选择性,硝酸盐相较于亚硝酸盐和铵盐更适合孢子的萌发。在氮代谢通路中,铵转运体基因（MeaA与MepA）在萌发过程中发挥了重要作用,其中MeaA是最主要铵转运体。4)对香豆酸与香叶醇通过影响黄曲霉孢子萌发过程中氮代谢相关基因以及氧化还原过程,可以显著的抑制黄曲霉孢子萌发。