华支睾吸虫病(clonorchiasis)，亦称肝吸虫病，是由华支睾吸虫(Clonorchissinensis，C. sinensis)感染引起的一种食源性人兽共患寄生虫病。该病主要流行于中国、日本、韩国、越南及其它东南亚国家，全世界有将近3,500万人感染，我国是最主要的流行区，感染人数约为1,249万。流行区的居民生食或食入未煮熟的含有华支睾吸虫活囊蚴的鱼、虾而感染，反复感染可使病情加重，导致胆囊炎、胆管炎、胆结石、肝纤维化甚至肝胆管癌。　　 近年来，华支睾吸虫感染率呈现增高的趋势，卫生部2001-2004年进行的全国(除台湾、香港、澳门外)人体重要寄生虫病流行现状调查结果显示，全国华支睾吸虫感染率平均达0.58％，流行区华支睾吸虫感染率为2.04％，与1990年的调查相比，感染率上升了75％。其原因主要有：改变流行区居民的饮食习惯十分困难；追求新鲜、生食或半生食鱼虾等成为新的饮食时尚；华支睾吸虫保虫宿主(猫、犬、鼠及其它野生动物)的不可控性等。由于鱼是肝吸虫最重要的中间宿主，因此防止鱼感染肝吸虫将对阻断该病的传播起到事半功倍的作用。但目前关于尾蚴如何侵入鱼体或者在鱼体内形成囊壁的机制的研究尚未见报道。　　 已有研究表明，丝氨酸蛋白酶在寄生原虫成囊过程中发挥着重要作用，其抑制剂可以显著降低成囊率，卡氏棘阿米巴的成囊和脱囊都与丝氨酸蛋白酶的作用密切相关。而丝氨酸蛋白酶作用的发挥必须受到其抑制剂的精确调控。事实上，许多研究已经表明寄生虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂可以抑制宿主的丝氨酸蛋白酶，在抵抗宿主的免疫中发挥重要作用，如：马来布鲁线虫微丝蚴的丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制人体中性粒细胞中的丝氨酸蛋白酶；曼氏血吸虫和埃及血吸虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂在维持自身的生理稳定及与宿主的相互作用中发挥双重作用。　　 目前关于华支睾吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究，除了genebank中有一条登录的序列外未见其它报道。那么，华支睾吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂是否也是成囊相关分子?成为我们迫切需要解决的问题。　　 因此，本研究从华支睾吸虫囊蚴cDNA文库中识别华支睾吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(将其缩写为CsSERPIN)基因，研究免疫学特性、生物学活性、阶段性表达及组织定位，为研究囊蚴的成囊机制及研制鱼用疫苗奠定基础。　　 1、研究目的：　　 从华支睾吸虫囊蚴cDNA文库中识别华支睾吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(将其缩写为CsSERPIN)，获得编码序列(CDS)，表达重组CsSERPIN蛋白(缩写为rCsSERPIN)并对其免疫学特性及生物学活性进行评价；比较该基因在华支睾吸虫成虫和囊蚴阶段mRNA和蛋白水平上的表达差异以及在虫体的定位，为研究囊蚴的成囊机制及研制鱼用疫苗奠定基础。　　 2、研究方法：　　 2.1 CsSERPIN基因的识别及全长序列的获得　　 对本室构建的华支睾吸虫囊蚴全长cDNA质粒文库的表达序列标签测序后进行UniGene归并，获得大批序列。通过BLASTx比对获得编码CsSERPIN蛋白的质粒文库的克隆号。将这些质粒导入大肠杆菌(E.coli)DH5α进行扩增，抽提质粒walking测序并进行序列拼接，BLASTx比对后确定全长序列。使用生物信息学技术对CsSERPIN蛋白的分子量、稳定性、功能域及高级结构等进行预测。　　 2.2基因的克隆表达和重组蛋白的纯化　　 根据目的基因的CDS和原核表达质粒pET-28a(+)的多克隆位点设计引物，以比对后确定编码CsSERPIN的文库质粒为模板，PCR扩增CsSERPIN，定向克隆该序列到质粒pET-28a(+)，并对重组质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定。将构建好的重组质粒pET-28a(+)-CsSERPIN转化E.coli BL21/DE并诱导表达后，Ni-IDA柱亲和层析获得纯化的rCsSERPIN，用小鼠His单抗对纯化的重组蛋白进行Western blotting鉴定。　　 2.3 rCsSERPIN的生物学特性和功能初步探讨　　 将纯化的rCsSERPIN免疫大鼠获得免疫血清，Western blotting观察免疫血清及感染华支睾吸虫的人和大鼠血清对相应的rCsSERPIN的识别能力，鉴定rCsSERPIN的免疫反应性。将rCsSERPIN行含明胶的SDS-PAGE后用胰蛋白酶水解，观察其对胰蛋白酶的作用；rCsSERPIN与胰蛋白酶和囊蚴共孵育，观察其对胰蛋白酶诱导的囊蚴脱囊的影响；同时通过观察重组蛋白对囊蚴脱囊的影响。　　 2.4 CsSERPIN在华支睾吸虫囊蚴和成虫阶段的表达差异　　 用Trizol法分别提取华支睾吸虫囊蚴和成虫的总RNA，逆转录后获得cDNA。以β-actin为内参，采用半定量法灰度扫描判断该基因囊蚴和成虫阶段表达的高低，SYBR GreenⅠ嵌合荧光法行Real Time PCR确定两阶段在mRNA水平上的表达差异；以rCsSERPIN免疫大鼠获得的血清以及感染华支睾吸虫的大鼠血清为一抗，Western blotting鉴定CsSERPIN蛋白在囊蚴和成虫阶段的表达。　　 2.5 CsSERPIN在华支睾吸虫囊蚴和成虫阶段的免疫定位　　 将华支睾吸虫囊蚴、成虫固定后石蜡包埋切片，免疫荧光法观察CsSERPIN在华支睾吸虫囊蚴和成虫阶段的组织定位。一抗用上述制备的初步纯化的抗rCsSERPIN的大鼠血清，二抗用荧光标记的抗大鼠IgG抗体。荧光显微镜下观察并拍照。　　 3、研究结果：　　 3.1 CsSERPIN基因的全长序列和生物信息学分析　　 从华支睾吸虫囊蚴cDNA文库中识别出两种丝氨酸蛋白酶抑制剂的编码基因，克隆号分别为133f12和84g02，将其暂命名为CsSERPIN1和CsSERPIN2。生物信息学分析结果显示，CsSERPIN1编码区长度为1149bp，编码382个aa残基，CsSERPIN2的编码区长度为1161bp，编码386个aa残基。CsSERPIN1和CsSERPIN2均无信号肽，均有SERPIN的功能域，但在功能域的反应位点环区域差异较大。CsSERPIN1无跨膜区，CsSERPIN2有跨膜区，可能为膜蛋白。　　 3.2 CsSERPIN的基因克隆和重组蛋白表达纯化　　 重组质粒pET28a(+)-CsSERPIN1和pET28a(+)-CsSERPIN2均构建成功，在E.coli BL21/DE中均可表达，且均有可溶性表达。两种重组蛋白都不够稳定，与生物信息学分析结果一致。用Ni-IDA柱亲和层析获得纯化得到纯化蛋白，rCsSERPIN1浓度达3000μg/ml；rCsSERPIN2的浓度为800μg/ml，较难纯化，可能与CsSERPIN2基因存在跨膜区有关。　　 3.3重组CsSERPIN蛋白的免疫学和生物学特性的初步研究获得得到大鼠抗rCsSERPIN1和rCsSERPIN2的免疫血清，滴度为均在51,200以上。　　 重组蛋白rCsSERPIN1和rCsSERPIN2均能够很好地识别相应的抗血清以及感染肝吸虫的大鼠血清和患者血清。rCsSERPIN1能够显著抑制胰蛋白酶对明胶的水解，且能够抑制胰蛋白酶对囊蚴的脱囊壁作用。rCsSERPIN2对胰蛋白酶不具有明显的抑制作用。　　 3.4 CsSERPIN在华支睾吸虫囊蚴和成虫阶段的表达差异　　 半定量、定量PCR和Western blotting结果均显示两个CsSERPIN基因在囊蚴阶段的表达均显著高于成虫阶段。囊蚴阶段CsSERPIN1基因的mRNA表达量为成虫阶段的3.249倍，囊蚴阶段CsSERPIN2的表达水平为成虫阶段的11.314倍。　　 3.5 CsSERPIN在华支睾吸虫囊蚴阶段的免疫定位　　 免疫荧光结果显示，CsSERPIN1在囊蚴主要定位于口吸盘，此外在皮下实质组织内有弥散分布。CsSERPIN2主要分布于囊壁以内的虫体表层。　　 4、研究结论：　　 4.1测序和生物信息学分析获得两个华支睾吸虫囊蚴CsSERPIN基因的全长序列，文库克隆号分别为133 f12和84g02。　　 4.2 rCsSERPIN1和rCsSERPIN2均具有免疫反应性。rCsSERPIN1蛋白对胰蛋白酶有较好的抑制作用。　　 4.3 CsSERPIN1和CsSERPIN2在华支睾吸虫囊蚴阶段的表达显著高于成虫阶段，提示CsSERPIN基因在囊蚴阶段可能发挥着重要作用。　　 4.4 CsSERPIN1和CsSERPIN2在囊蚴的定位不同，提示其可能具有不同的生理功能。