研究背景肝纤维化是慢性肝损伤的修复反应,以细胞外基质(ECM)合成与降解失衡、ECM异常净沉积为特征,是损伤-炎症-再生-修复综合病理反应的结果,反复的损伤和炎症反应是肝纤维化进展的重要机制。肝纤维化发病率高,预后不良,不进行临床干预的后果是发展为肝硬化和肝细胞癌;肝硬化病程较长,因其严重并发症影响病患生存质量,经济压力沉重;肝癌除经济因素外,直接威胁病人的生命。没有经批准的药物治疗是肝纤维化疾病发病率和死亡率高的主要原因。而肝移植作为终末期肝病患者唯一有效的解决方案极其昂贵;且对肝移植而言,全国范围内肝源供体不足,实施条件严格,技术难度大,无法广泛推广。在过去的几十年中,有关肝纤维化的研究普遍认为肝脏具有潜在的再生能力,而且肝纤维化具有可逆性,肝星状细胞(HSC)是肝纤维化发病机制的主要调节因子,TGF-β通过旁分泌或自分泌的方式活化HSC,调控肝纤维化过程中胶原纤维等细胞外基质的合成、降解及异常堆积。转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是属于一组结构相关的多效分泌细胞因子的超家族,由在各种细胞和组织类型中发现的配体组成,它们在发育、组织稳态和疾病过程中的大量基本细胞事件中发挥无处不在的作用。TGF-β超家族由33个成员组成,具体见综述表1。TGF-β家族的成员有不同的时间和组织表达特异性,在包括免疫细胞在内的许多不同细胞类型的分化、增殖和活化状态中起关键作用,在生物体中大多数组织的发育、稳态和修复中发挥重要作用。所有免疫细胞谱系,包括B细胞,T细胞和树突细胞以及巨噬细胞分泌TGF-β,负调节其增殖,分化和其他细胞因子的活化,TGF-β信号传导的干扰与自身免疫,炎症和癌症均有密切关。TGF-β在器官纤维化的进展中起关键作用,是导致大多数慢性肝脏、肾脏、心脏、皮肤等器官纤维化的主要因素。TGF-β1可通过激活经典Smad通路和非经典Smad通路诱导器官纤维化[1],从而导致肌成纤维细胞的活化,ECM的过量产生和ECM的抑制降解。抑制TGF-β信号传导通路可限制疾病模型中的肾纤维化,然而由于TGF-β参与其他生命过程,直接靶向TGF-β不太可能实现可行的抗纤维化治疗途径;在临床试验中已证明阻断TGF-β1的疗法无效。在糖尿病肾病中,TGF-β1单克隆抗体治疗肾纤维化的二期临床试验显示,TGF-β1单克隆抗体治疗组与安慰剂组之间血清肌酐的差异没有统计学意义;TGF-β1缺陷型小鼠与对照小鼠相比,显示伤口修复严重受损,包括再上皮化和胶原沉积减少;缺乏TGF-β1的小鼠也表现出严重的消瘦综合征,伴有明显的全身性炎症反应和组织坏死,可导致器官衰竭和死亡;TGF-β及其信号通路中信号的基因在发育和成年心脏中表达,TGF-β1和TGF-β2基因的靶向破坏导致不同程度的心脏缺陷,包括心房间隔和心室流出道间充质细胞的心肌化失败以及瓣膜分化不足。最近的研究还表明TGF-β1信号通路中Smad5的缺失导致心脏发育异常、心肌细胞凋亡;上述结果说明了使用TGF-β1作为抗纤维化靶标的局限性。目的:1.用CCL4干预小鼠,诱导建立小鼠肝纤维化的动物模型。2.检测肝纤维化动物模型血清学指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平,组织学观察模型病理学表现;观察应用ICG001、ICG001联合TGF-β后小鼠血清ALT、AST的水平,组织学观察治疗后病理学改变。3.检测ICG001联合TGF-β对CCL4致小鼠肝纤维化中Col-Ⅰ、α-SMA及FOXO1蛋白表达和基因表达。4.研究ICG001、TGF-β及FOXO1在治疗肝纤维化中的作用。方法:1.应用CCL4建立小鼠肝纤维化的动物模型:将C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组、模型组,对照组腹腔注射橄榄油0.1m L,实验组腹腔注射20%CCL4(溶质为橄榄油),每周2次,持续到终点。每2周处理1次,在实验组、模型组中各随机选取3只小鼠处死,眼球取血,留取肝脏组织,体式显微镜下观察大体情况,部分肝脏固定切片。2.对小鼠CCL4致肝纤维化模型的治疗:将48只C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组、模型组、ICG001组和ICG001联合TGF-β组(IT组);模型组、ICG001组和IT组腹腔注射20%CCL40.1m L,每周2次,共6周;对照组腹腔注射0.2m L生理盐水,每周2次,共6周;建模第5周开始,ICG001组和IT组腹腔注射ICG001(5mg/kg),每日1次,共两周;IT组腹腔注射TGF-β(5mg/kg),每2日1次,共两周。第6周末检测各组小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量;收集各组小鼠肝脏组织,体式显微镜下观察大体情况,部分肝脏固定切片,剩余部分-80℃超低温保存,以供后续实验。3.提取各组小鼠肝组织蛋白,提取各组小鼠蛋白,Western Blot检测α-SMA、Col-Ⅰ、FOXO1的蛋白表达量。4.提取各组小鼠肝组织RNA,q-PCR检测IL-6、IL-10、TNF-α、α-SMA、Col-Ⅰ、FOXO1表达量;5.根据资料类型不同,先使用单因素方差分析检验各样本是否来自同一总体,然后用t检验(Fisher确切概率法)分析组间差异。结果:1.第一部分:模型组血清学指标AST、ALT远超过对照组;第二部分:模型组血清学指标AST、ALT远超过对照组(ALT:t=18.36,P<0.01;AST:t=8.83,P<0.01);与模型组相比,ICG001组血清学指标下降(ALT:t=8.12,P<0.01;AST:t=5.59,P<0.01),IT组的下降程度更明显(ALT:t=11.75,P<0.01;AST:t=7.76,P<0.01);2.组织学检查提示:模型组的炎性细胞聚集于门静脉及中心静脉周围,实质细胞中亦可见多量炎性细胞浸润,ICG001组及IT组均可见实质细胞中炎性细胞减少,且IT组的改善程度较ICG001组明显;网状纤维染色示:模型组网状纤维粗大且有突起伸出,呈不规则分布;与模型组相比,ICG001组纤维较模型组变细,突起减少,IT组的改善程度较ICG001组更明显。3.Western Blot结果:与对照组相比,α-SMA、Col-Ⅰ蛋白在模型组中显著升高(Col-Ⅰ:t=7.22,P<0.01;α-SMA:t=17.72,P<0.011),ICG001组有所下降(Col-Ⅰ:t=8.08,P<0.01;α-SMA:t=8.42,P<0.01),IT组的下降程度更为显著Col-Ⅰ:t=5.87,P<0.01;α-SMA:t=4.22,P<0.05);模型组与对照组比较,FOXO1无统计学差异(t=1.44,P=0.22>0.05),ICG001组较模型组无统计学差异(t=1.48,P=0.212>0.05),IT组较ICG组升高(t=3.51,P<0.05。)4.q-PCR结果示:炎症因子IL-6、TNF-α、α-SMA及Col-Ⅰ在模型组有显著提升(IL-6:t=10.61,P<0.01;TNF-α:t=89.83,P<0.01;α-SMA:t=22.92,P<0.01;Col-Ⅰ:t=13.73,P<0.01),ICG001组较模型组下降(IL-6:t=9.91,P<0.01;TNF-α:t=58.93,P<0.01;α-SMA:t=16.57,P<0.01;Col-Ⅰ:t=6.22,P<0.01),IT组较ICG001组下降明显(IL-6:t=5.39,P<0.01;TNF-α:t=4.54,P<0.05;α-SMA:t=4.58,P<0.05;Col-Ⅰ:t=3.36,P<0.05);抗炎因子IL-10在模型组中升高(t=6.48,P<0.01),ICG001组较模型组升高(t=3.67,P<0.05),IT组升高更为明显(t=3.35,P<0.05);FOXO1在模型组中升高(t=10.06,P<0.01),ICG001组与模型组相比无统计学差异(t=2.51,P=0.066>0.05),IT组升高(t=4.99,P<0.01)。结论:1.应用CCL4成功建立了小鼠肝纤维化的动物模型,经过比较,选取了第5周作为药物干预的节点。2.与单用ICG001相比,ICG001联合TGF-β对CCL4所致的肝纤维化有更好地改善作用,可能与ICG001作用于TGF-β通路引起FOXO1变化有关。