目的中医“心主神明”理论认为:心为君主之官,可主宰一切生命活动和精神意识活动。本研究基于“心主神明”理论,结合广泛性焦虑症(generalized anxiety disorder,GAD)心阴亏虚证的病因病机,根据“五脏应五音,心属火,在音为徵,徵动心”的作用原理,以“徵调音乐从心论治GAD”为切入点,观察徵调音乐疗法对GAD心阴亏虚证大鼠焦虑行为及心阴亏虚症状的影响,检测GAD大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA axis)相关激素浓度及受体基因表达水平。一方面,旨在建立和评价GAD心阴亏虚证大鼠模型,为徵调音乐疗法干预GAD心阴亏虚证提供实验研究载体。另一方面,将“心主神明”理论用于指导五音疗法治疗GAD,同时,依托先进的酶联免疫技术、分子生物学技术,从HPA轴角度揭示徵调音乐疗法发挥抗焦虑效应的关键靶点和作用机制。方法本研究采用随机区组设计,以体重为区组因素,将48只SD大鼠按体重由低到高排序,体重相邻的6只大鼠为1个区组,共8个区组(区组1~区组8)。每个区组内的6只大鼠再按照随机数字表法被随机分入6个处理组,即空白组、模型组、天王补心丸组、地西泮片组、徵调音乐组、西洋音乐组,每组8只大鼠。实验包括造模、干预及评价三个部分:(1)GAD心阴亏虚证动物模型的建立与评价:(1)GAD心阴亏虚证动物模型的建立:空白组不进行任何处理,其余各组先通过3周的不确定性空瓶应激法建立GAD疾病模型,再采用水环境小站台睡眠剥夺法持续剥夺大鼠72h睡眠,建立大鼠心阴亏虚证候模型,以此构建GAD心阴亏虚病证结合模型。(2)GAD心阴亏虚证动物模型的评价:造模结束后,通过国际公认的高架十字迷宫实验和旷场实验初步验证GAD模型是否构建成功,实验结束时结合大鼠微观检测指标再次验证GAD模型的科学性与稳定性;参考中医心阴亏虚辨证方法,将人体辨证所需的部分定性指标转化为动物的定量指标(如心率、收缩压、呼吸频率、肛温等),再结合大鼠的精神、活动、体型、饮食、毛发、二便等一般情况对大鼠的宏观表征进行综合评价,如果其宏观表征符合心阴亏虚证的症状体征表现,则大鼠的心阴亏虚证候模型初步构建成功,实验结束时结合大鼠微观检测指标及“以方验证(天王补心丸)”结果再次验证心阴亏虚证候模型的可靠性。(2)药物及音乐干预阶段:GAD心阴亏虚证模型初步验证成功后,开始进行干预。空白组和模型组不给予任何处理。天王补心丸组给予天王补心丸灌胃,给药剂量为0.74g/kg,1次/d;地西泮片组给予地西泮片灌胃,给药剂量为lmg/kg,1次/d。徵调音乐组和西洋音乐组分别播放徵调音乐和西洋音乐,1次/d,45min/次。以上干预均为一周一个疗程,连续干预3个疗程,共21天。(3)实验结果评价:(1)一般情况及体重评价:每日观察大鼠精神、活动、二便、饮食等一般情况,每周测量大鼠体重。(2)行为学评价:于造模前后及干预第1、2、3周末通过高架十字迷宫实验和旷场实验观察大鼠行为学变化。(3)生命体征评价:于造模前后及干预第3周末检测大鼠收缩压、心率、呼吸、肛温水平。(4)实验室指标评价:于干预第3周末,采用ELISA法检测大鼠下丘脑CRH、血清ACTH、CORT浓度,通过RT-PCR法检测大鼠下丘脑CRH RⅠmRNA、CRH RⅡmRNA及海马GR mRNA表达水平。结果至干预第3周末,共46只大鼠完成实验,2只大鼠死亡,均来自于地西泮片组。具体实验结果如下。1.造模前各指标比较结果造模前各组大鼠一般情况较好,无明显异常。单因素方差分析结果显示:各组大鼠体重比较差异无统计学意义(P>0.05)。随机区组方差分析结果显示:各组大鼠OE%值、OT%值、水平运动次数、垂直运动次数、收缩压、心率、呼吸频率、肛温组间比较、区组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。2.造模后各指标比较结果2.1一般情况及体重2.1.1一般情况空白组大鼠一般情况无明显异常。其余各组大鼠造模结束后精神萎靡、反应迟钝、毛色暗淡、饮水增加、摄食下降、大便干燥、体型消瘦,好聚集于饲养笼一端,还伴有修饰、回避、活动性降低等行为学改变。2.1.2体重单因素方差分析结果显示:造模后各组大鼠体重组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。进一步组间两两比较显示,其余各组与空白组大鼠体重比较,差异有统计学意义(P<0.05)。2.2行为学结果随机区组方差分析结果显示:造模后各组大鼠OE%值、OT%值、水平运动次数、垂直运动次数比较,组间差异有统计学意义(P<0.05),区组间差异无统计学意义(P>0.05)。进一步组间两两比较显示,其余各组与空白组大鼠OE%值、OT%值、水平运动次数、垂直运动次数比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。2.3生命体征结果随机区组方差分析结果显示:造模后各组大鼠收缩压、心率、呼吸频率、肛温比较,组间差异有统计学意义(P<0.05),区组间差异无统计学意义(P>0.05)。进一步组间两两比较显示,其余各组与空白组大鼠收缩压、心率、呼吸频率、肛温比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。3.干预后各指标比较结果3.1一般情况及体重3.1.1一般情况空白组一般情况无明显异常。模型组精神萎靡,眼神暗淡,进食偏少,饮水增多,体形偏瘦,弓背,毛色枯槁无光泽,活动反应迟钝,喜扎堆,大便尚可,小便较多。天王补心丸组、地西泮片组、徵调音乐组、西洋音乐组上述一般情况有所改善,大鼠精神渐佳,毛色有泽,饮食渐增,体重增加,行动灵敏,修饰行为增多。3.1.2体重(1)单因素方差分析结果显示:(1)组间比较:干预第1、2、3周末各组大鼠体重组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)组间两两比较显示:干预第1、2周末,天王补心丸组、地西泮片组、徵调音乐组、西洋音乐组与模型组大鼠体重比较,差异均无统计学意义(P>0.05);干预第3周末,地西泮片组与模型组大鼠体重差异有统计学意义(P<0.01),天王补心丸组、徵调音乐组、西洋音乐组与模型组大鼠体重比较,差异无统计学意义(P>0.05)。干预后各时间点,天王补心丸组与地西泮片组体重比较,徵调音乐组与西洋音乐组体重比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)重复测量方差分析结果显示:(1)时间、组间、交互效应:大鼠体重在不同时间、不同组别间差异有统计学意义(P<0.01),且组间和时间效应之间存在交互作用(P<0.01)。(2)时间变化趋势图结果显示:实验过程中,空白组体重整体呈增长趋势,增长幅度稳定,但干预第2周末体重有所下降。其余各组大鼠体重在造模后明显低于空白组。干预后,除模型组大鼠体重呈缓慢增长趋势外,地西泮片组大鼠体重增长速度最快,西洋音乐组次之,其后为天王补心丸组、徵调音乐组,至干预结束时,模型组体重仍较低,地西泮片组、天王补心丸组、徵调音乐组、西洋音乐组体重已接近空白组。3.2行为学结果3.2.1高架十字迷宫实验结果(1)随机区组方差分析结果显示:(1)组间比较、区组间比较:干预第1、2、3周末,各组大鼠OE%值、OT%值比较,组间差异有统计学意义(P<0.05),区组间差异无统计学意义(P>0.05)。(2)组间两两比较显示:干预第1、2、3周末,模型组与空白组OE%值、OT%值比较,差异均有统计学意义(P<0.05);天王补心丸组、地西泮片组、徵调音乐组、西洋音乐组与模型组OE%值、OT%值比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。干预后各时间点,天王补心丸组与地西泮片组OE%值、OT%值比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。干预第1周末,徵调音乐组与西洋音乐组OE%值差异无统计学意义(P>0.05),OT%值差异有统计学意义(P<0.05);干预第2周末,徵调音乐组与西洋音乐组OE%值、OT%值差异均无统计学意义(P>0.05);干预第3周末,徵调音乐组与西洋音乐组OE%值差异有统计学意义(P<0.05)、OT%值差异无统计学意义(P>0.05)。(2)重复测量方差分析结果显示:(1)时间、组间、交互效应:大鼠OE%、OT%值在不同时间、不同组别间差异均有统计学意义(P<0.01),且组间和时间效应之间存在交互作用(P<0.05)。(2)组内两两比较结果显示:OE%值:空白组、模型组各时间点OE%值组内两两比较差异无统计学意义(P>0.05);天王补心丸组、地西泮片组、徵调音乐组造模后与干预第1、2、3周末OE%值比较差异均有统计学意义(P<0.05);西洋音乐组造模后与干预第2、3周末OE%值比较差异有统计学意义(P<0.01)。OT%值:空白组造模后与干预第2周末OT%值比较差异有统计学意义(P<0.05);模型组干预第1周末与干预第3周末OT%值比较差异有统计学意义(P<0.05);天王补心丸组、地西泮片组、徵调音乐组、西洋音乐组造模后与干预第1、2、3周末OT%值比较差异有统计学意义(P<0.05)。(3)时间变化趋势图结果显示:空白组OE%值、OT%值随时间变化较稳定。其余5组大鼠OE%值、OT%值在造模后明显低于空白组。干预后,除模型组大鼠OE%值、OT%值在相对较低水平波动增长外,其余各组大鼠OE%值、OT%值呈整体上升趋势,至干预结束时,地西泮片组、天王补心丸组、徵调音乐组、西洋音乐组OE%值、OT%值与空白组相当,且均明显高于模型组。3.2.2旷场实验结果(1)随机区组方差分析结果显示:(1)组间比较、区组间比较:干预第1、2、3周末,各组大鼠水平运动次数、垂直运动次数组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。除干预第1周末的水平运动次数区组间差异有统计学意义(P<0.05)外,其余时间点大鼠水平运动次数、垂直运动次数区组间差异无统计学意义(P>0.05)。(2)组间两两比较结果显示:干预第1、2、3周末,模型组与空白组水平运动次数、垂直运动次数比较,差异均有统计学意义(P<0.05);天王补心丸组、地西泮片组、徵调音乐组与模型组水平运动次数、垂直运动次数比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。干预第1周末,西洋音乐组与模型组水平运动次数差异有统计学意义(P<0.05)),与模型组垂直运动次数差异无统计学意义(P>0.05)),干预第2、3周末,西洋音乐组与模型组水平运动次数、垂直运动次数比较,差异有统计学意义(P<0.05)。干预后各时间点,天王补心丸组与地西泮片组水平运动次数、垂直运动次数比较,徵调音乐组与西洋音乐组水平运动次数、垂直运动次数比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)重复测量方差分析结果显示:(1)时间、组间、交互效应:大鼠水平运动次数在不同时间、不同组别间差异均有统计学意义(P<0.01),且组间和时间效应之间存在交互作用(P<0.01)。大鼠垂直运动次数在不同时间、不同组别间差异均有统计学意义(P<0.01),但组间和时间效应之间不存在交互作用(P>0.05)。(2)组内两两比较结果显示:水平运动次数:空白组造模后与干预第1周末水平运动次数比较差异有统计学意义(P<0.05);模型组各时间点两两比较水平运动次数差异无统计学意义(P>0.05);天王补心丸组、地西泮片组造模后与干预第1、2、3周末水平运动次数比较差异有统计学意义(P<0.05);徵调音乐组造模后与干预第1周末,干预第1周末与干预第2周末水平运动次数比较差异有统计学意义(P<0.05);西洋音乐组造模后与干预第1、2、3周末,干预第2周末与干预第3周末水平运动次数比较差异有统计学意义(P<0.05)。垂直运动次数:空白组造模后与干预第1周末垂直运动次数比较差异有统计学意义(P<0.05);模型组各时间点两两比较垂直运动次数差异无统计学意义(P>0.05);天王补心丸组造模后与干预第1、2、3周末垂直运动次数比较差异有统计学意义(P<0.05);地西泮片组造模后与干预第1、2周末垂直运动次数比较差异有统计学意义(P<0.05);徵调音乐组造模后与干预第1、3周末垂直运动次数比较差异有统计学意义(P<0.05);西洋音乐组造模后与干预第1、2周末垂直运动次数比较差异有统计学意义(P<0.05)。(3)时间变化趋势图结果显示:空白组水平运动次数、垂直运动次数随时间变化较稳定。其余各组大鼠水平运动次数、垂直运动次数在造模后明显低于空白组。干预后,除模型组大鼠水平运动次数、垂直运动次数值在相对较低水平波动变化外,其余干预组大鼠水平运动次数、垂直运动次数呈整体上升趋势,干预第2周末有所下降,至干预结束时,地西泮片组、天王补心丸组、徵调音乐组、西洋音乐组水平运动次数、垂直运动次数与空白组相当,且均明显高于模型组。3.3生命体征结果3.3.1收缩压、心率结果随机区组方差分析结果显示:(1)组间比较、区组间比较:干预第3周末,各组大鼠收缩压、心率比较,组间差异有统计学意义(P<0.01),区组间差异无统计学意义(P>0.05)。(2)组间两两比较显示:模型组与空白组收缩压、心率比较,差异均有统计学意义(P<0.01);天王补心丸组、地西泮片组、徵调音乐组、西洋音乐组与模型组收缩压、心率比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。天王补心丸组与地西泮片组收缩压、心率比较,徵调音乐组与西洋音乐组收缩压、心率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。3.3.2呼吸频率、肛温结果随机区组方差分析结果显示:(1)组间比较:干预第3周末,各组大鼠呼吸频率、肛温组间比较,组间差异有统计学意义(P<0.01),区组间差异无统计学意义(P>0.05)。(2)组间两两比较显示:模型组与空白组呼吸频率、肛温比较,差异均有统计学意义(P<0.01);天王补心丸组、地西泮片组、徵调音乐组、西洋音乐组与模型组呼吸频率、肛温比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。天王补心丸组与地西泮片组呼吸频率、肛温比较,徵调音乐组与西洋音乐组呼吸频率、肛温比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。3.4实验室结果3.4.1 HPA轴相关激素浓度结果随机区组方差分析结果显示:(1)组间比较、区组间比较:干预第3周末各组大鼠CRH、ACTH、CORT比较,组间差异有统计学意义(P<0.01),区组间差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)组间两两比较显示:模型组与空白组大鼠CRH、ACTH、CORT比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。天王补心丸组、地西泮片组、徵调音乐组、西洋音乐组与模型组CRH、ACTH、CORT比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。天王补心丸组与地西泮片组CRH、ACTH、CORT比较,徵调音乐组与西洋音乐组CRH、ACTH、CORT比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。3.4.2 HPA轴相关受体基因表达水平结果随机区组方差分析结果显示:(1)组间比较、区组间比较:干预第3周末,各组大鼠下丘脑CRH RⅠmRNA、海马GR mRNA组间比较,差异有统计学意义(P<0.01),各组大鼠下丘脑CRH RⅡmRNA组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠下丘脑CRH RⅠmRNA、CRH RⅡmRNA、海马GR mRNA区组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)组间两两比较显示:模型组与空白组大鼠下丘脑CRH RⅠmRNA、海马GR mRNA比较,差异有统计学意义(P<0.01)。天王补心丸组、地西泮片组、徵调音乐组、西洋音乐组与模型组下丘脑CRH RⅠmRNA、海马GR mRNA比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。天王补心丸组与地西泮片组下丘脑CRH RⅠmRNA、海马GR mRNA比较,徵调音乐组与西洋音乐组下丘脑CRH RⅠmRNA、海马GR mRNA比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠下丘脑CRH RⅡmRNA组间两两比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论本研究通过不确定性空瓶应激法结合水环境小站台睡眠剥夺法构建了GAD心阴亏虚病证结合模型,并从宏观表征、微观指标、以方验证(天王补心丸)三个角度对该模型进行了综合评价,结果表明此方法成功构建了GAD心阴亏虚病证结合模型。以该模型为研究载体,基于“心主神明”理论的徵调音乐疗法有效改善了GAD心阴亏虚大鼠的焦虑行为和心阴亏虚症状,明显降低了大鼠下丘脑CRH、血清ACTH、CORT浓度,下调了下丘脑CRHRⅠmRNA表达水平,增加了海马GR mRNA的表达量,结果说明徵调音乐疗法可能通过抑制HPA轴起始环节的过度激活以及增强海马-HPA轴负反馈调节功能来抑制HPA轴过度亢进,进而发挥抗焦虑效应。