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【研究背景】
缺血性心脏病发病率和死亡率高，严重威胁人类的健康。过去缺血性心脏病主要的死因是急性心梗及其并发症。但是随着介入、架桥等血管再通和心脏辅助技术的发展，心梗的急性期死亡率显著下降，而继发于心梗的病理性心肌重构往往预后不良，导致严重的心衰，目前其死亡人数远远超过急性心肌梗死，已经成为了缺血性心脏病患者死亡的首要原因。因此如何有效地干预心梗后病理性心肌重构成为亟待解决的问题。
心肌梗死(myocardial infarction，MI)后，坏死的心肌细胞被瘢痕组织所取代，而不具有收缩功能的瘢痕组织会进一步引起梗死面积扩大，最终使心室扩张成球形，是心梗后心脏发生病理性心肌重构，最终走向心衰的主要病理生理改变。间充质基质细胞(mesenchymal stromal cells, MSCs)移植是治疗心梗后病理性心肌重构有效的治疗方案。研究表明，MSCs能通过旁分泌细胞因子、外泌体或者通过细胞间线粒体转移等多种机制改善心肌梗死后心脏的功能和结构。然而，临床研究证实MSCs疗效并没有动物模型显著，可能的原因是MSCs在缺血缺氧等微环境中急速凋亡和存活不良。通过遗传修饰增强MSCs的抗损伤能力被认为是改善MSCs存活和定植的有效手段。
C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白-3(CTRP3)是一种新近发现的脂肪因子，我们课题组前期报道CTRP3能抑制MI后心脏的病理性重构，并且我们的预实验证实MSCs表达和分泌CTRP3，且在损伤应激下，MSCs表达和分泌CTRP3明显下降。但是CTRP3是否是MSCs的细胞保护因子，通过基因修饰CTRP3改造MSCs是否能改善MSCs的心肌保护作用，目前尚不清楚。本研究通过基因干预手段高表达或低表达CTRP3后，观察MSCs对MI疗效的影响，并进一步探讨可能的机制。
【研究目的】
1.分离培养和纯化骨髓MSCs，检测MSCs表达分泌CTRP3的情况，并探索过氧化氢损伤对MSCs表达分泌CTRP3的影响。
2.通过慢病毒体外感染构建CTRP3高表达或低表达的MSCs，体内移植后观察不同CTRP3表达水平的MSCs对MI小鼠心脏功能、左室重构和血管新生的影响，并分析不同组MSCs在体内的生存和定植情况。
3.通过细胞共培养探讨CTRP3表达水平对MSCs自身生物学行为的影响，并探讨可能的分子机制。
【研究方法】
1.实验动物：1)8周龄C57BL/6J雄性小鼠由空军军医大学实验动物中心提供；2)CTRP3基因敲除鼠(CTRP3-KO)小鼠由K&D基因科技有限公司(武汉,中国)构建。
2.基因干预：1)慢病毒过/低表达MSCs中CTRP3:GFP标记的CTRP3慢病毒(LvCTRP3)和空载对照慢病毒(LvNull)均由上海吉凯基因科技有限公司构建；GFP标记的CTRP3-shRNA慢病毒(LVshC3)和对照Lv3-NC慢病毒(Lvshctrl)由上海吉玛基因科技有限公司构建。将第四代(P4)MSCs培养至40-50％汇合，然后以50的感染复数感染细胞48h。通过用荧光显微镜计数GFP阳性的细胞来评价感染效率，通过WesternBlot检测慢病过表达和低表达效率。
3.在体研究：1)建立C57BL/6J小鼠MI模型：8周龄C57BL/6J雄性小鼠经2%异氟烷麻醉，在左侧胸壁3-4肋间做1cm斜行切口，暴露心脏后顺势将心脏挤出，找出心脏冠状动脉左前降支，在左心耳下缘2mm处用6-0丝线结扎。2)MI模型建立后，立刻在心肌梗死周边三点注射25μLPBS或不同组别MSCs。研究CTRP3过表达时，分组如下：①MI+PBS(n=20)；②MI+MSCs(n=22)；③MI+LvC3-MSCs(n=26)；④MI+LvNull-MSCs(n=19)。当研究CTRP3低表达，分组如下：①MI+PBS(n=20)；②MI+MSCs(n=20)；③MI+LvShC3-MSCs(n=20)；④MI+Lvshctrl-MSCs(n=20)，然后分别行相关指标检测。3)超声心动图检测：MI后第1，7和28天，用Visualsonicvevo2100高分辨率小动物在体超声成像系统，记录动物超声心动图，计算LVEF。4)MI第28天的心脏标本用4％多聚甲醛固定过夜并包埋后，将心脏冠状切片至5μm厚，行Masson染色，通过ImageJ软件测量心脏纤维化程度。4)心肌细胞凋亡检测：MI后4周，使用TUNEL试剂盒染色心脏石蜡切片，通过计数凋亡细胞数量定量分析心肌细胞凋亡。5)免疫荧光染色分析梗死周围细胞成分：MI后4周心脏组织OCT包埋固定切片，分别进行vWF、α-SMA和vimentin染色，采集荧光照片，计算血管新生和纤维细胞数量。6)MSCs体内监测：MI后第1,7和14天心脏标本制备8μm厚冷冻切片，免疫荧光分析GFP阳性细胞比率。
4.体外实验：1)MSCs的鉴定：流式细胞术分析表面标记分子CD29、CD34、CD44、CD45；体外诱导分化实验评估MSCs的脂肪形成和成骨分化潜能。2)迁移实验：共培养迁移实验中，MSCs接种在transwell小室内，接收孔接种MSCs，LvC3-MSCs，LvNull-MSCs或C3-/-MSCs(CTRP3-KO)。CTPP3蛋白直接作用时，MSCs接种在transwell小室内，接收孔加入不同浓度的hCTRP3，24h后结晶紫染色，光镜下计数迁移细胞数量。4)细胞增殖和活性检测：①为评估MSCs，LvC3-MSCs，LvNull-MSCs或C3-/-MSCs来源的条件培养基(conditioned medium， CM)处理的MSCs的增殖和氧化损伤情况，将MSCs，LvC3-MSCs，LvNull-MSCs或C3-/-MSCs接种在培养皿，24h后收集CM。为了检测细胞增殖能力，将MSCs与不同CM共培养；为了检测抗氧化活性，将MSCs与不同CM和400μMH2O2一起孵育24h。②细胞增殖或活性检测：将细胞与10％CCK-8溶液温育2-4h后使用微孔板分光光度计在450nm处检测吸光度。4)流式细胞仪检测细胞凋亡：V-FITC和PI染色后，使用流式细胞仪定量检测凋亡细胞。5)LDH释放实验：收集细胞上清液，并使用LDH细胞毒性测定试剂盒，根据制造商的说明进行检测。6)RT-PCR筛选：MSCs经CTRP3蛋白孵育24h后，检测66个与MSCs增殖、迁移、氧化、凋亡等功能相关基因的表达。6)凝胶酶谱法检测MMPs活性：MSCs经CTRP3蛋白孵育24h后，收集细胞培养液，离心浓缩后，在含有1%SubstrateG的凝胶中电泳后用考马斯亮蓝染液染色凝胶，脱色液处理后采集凝胶图片，Bio-Rad软件定量分析MMP9活性。7)Westernblot检测CTRP3、CCNA2、CCNB1、Nusap1、MMP3、MMP9、MT1/2、SOD2、pAKT、AKT、pERK1/2、ERK1/2、p-AMPK、AMPK、p-JNK、JNK和GAPDH蛋白表达。
5.统计分析：所有数据均表示为n个独立实验的平均值±标准差。使用GraphPadPrism-6统计软件(La Jolla，CA，USA)分析数据。通过非配对的双尾t检验分析两组之间的差异。使用单因素方差分析(ANOVA)，然后使用Bonferroni事后检验来比较三组或多组差异。通过Kaplan-Meier方法进行生存率分析，然后进行对数秩检验。时间和组间差异通过双因素方差分析检验，然后进行事后检验。P值小于0.05被认为具有统计学差异。
【研究结果】
1.从小鼠骨髓中分离的细胞表现MSCs特征，并且H2O2处理下调了MSCs中CTRP3的表达和分泌。小鼠骨髓来源的P4代单核细胞形态均一，似纺锤体。流式细胞术分析显示，培养的MSCs表达标记分子CD29和CD44，但不表达CD34和CD45。MSCs能在体外被诱导诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。RT-PCR和蛋白质印迹结果表明MSCs在正常培养条件下表达CTRP3，而H2O2处理减少MSCs中CTRP3mRNA表达(P＜0.001)和蛋白表达水平(P＜0.01)，抑制CTRP3分泌(P＜0.01)。
2.CTRP3过表达的MSCs可改善MI小鼠的生存率，恢复左心室心功能和抑制心脏病理性重塑，此效应与CTRP3-MSCs在MI区域的存活率增加有关。1)LvC3-MSCs或LvNull-MSCs通过心肌内注射移植到左心室梗死边界区。在细胞注射后7天检测心脏组织蛋白表达证实LvC3-MSCs组梗死边界区CTRP3表达水平明显增高(依次P＜0.01vs.MI+LvNull-MSCs;P＜0.05vs.MI+MSCs)。MI+PBS组小鼠4周后生存率45％，而LvC3-MSCs组小鼠存活率进一步增加至84％(P＜0.05vs.MI+PBS)。在MI后第1,7和28天用超声心动图分析评估左心室心脏功能。MI后第1天各组LVEF没有差异。然而在MI后第7天，与MI+PBS组相比，MI+MSCs和MI+LvNull-MSCs组小鼠LVEF显著改善(均P＜0.05)。此外，在MI后第7天和第28天,较MI+LvNull-MSCs组，LvC3-MSCs组LVEF进一步增加(依次P＜0.01，P＜0.001)；MI后28天的大体解剖和Masson染色结果表明，与MI+PBS组相比，MSCs可降低心脏大小/质量比值(P＜0.01)，增加心肌细胞/纤维化细胞比率(P＜0.01)和减轻间质纤维化(P＜0.05)。而MI+LvC3-MSCs组进一步抑制MI后病理性心脏重塑(均P＜0.05vs.MI+LvNull-MSCs)；Tunel染色结果证实LvC3-MSCs组心肌细胞凋亡显著下降(P＜0.01vs.MI+MSCs)；vWF和αSMA免疫组织化学染色结果表明与注射PBS相比，心脏梗死边缘区注射MSCs后的毛细血管(P＜0.05)和小动脉的密度(P＜0.01)增加。而与MI+LvNull-MSCs组相比，注射LvC3-MSCs组的心脏毛细血管(P＜0.05)和小动脉(P＜0.01)新生进一步增加。通过免疫荧光显微镜分析移植后第1,7和14天心脏中MSCs存活情况，结果显示GFP标记的MSCs在注射部位周围呈簇样分布，并且仅在有限时间内存活。在MI后第1天，LvC3-MSCs和LvNull-MSCs移植细胞数量无显著差别，而在MI后7天LvC3-MSCs组GFP阳性细胞数量明显较多(P＜0.01)。另外，仅有非常小比例MSCs分化为内皮细胞，并且在LvC3-MSCs和LvNull-MSCs组之间内皮细胞分化数量无显著差异(P＞0.5)。同时我们未发现MSCs向血管平滑肌细胞分化。
3.沉默CTRP3表达可损害MSCs对心脏功能和左心室心脏重塑的保护作用。在MI后28天，CTRP3敲低可减弱MSCs对心脏射血功能的恢复作用(P＜0.01vs.MI+Lvshctrl-MSCs)。此外，与Lvshctrl-MSCs组相比，LvshC3-MSCs不仅增加心脏纤维化(P＜0.01)和间质纤维化(P＜0.05)，而且还减少MI边界区毛细血管密度(P＜0.05)和小动脉密度(P＜0.001)。进一步评估各组MSCs的存活，结果显示与Lvshctrl-MSCs组相比，LvshC3-MSCs组MSCs的存活数量减少(P＜0.01)。
4.MSCs分泌的CTRP3诱导MSCs迁移并保护MSCs抵抗H2O2诱导的细胞凋亡。CCK-8结果显示，与来自MSCs的CM相比，在处理后48h，LvC3-MSCs的CM和C3-/-MSCs的CM都没有对MSCs增殖产生影响。共培养实验表明，与LvNull-MSCs相比，LvC3-MSCs促进MSCs迁移(P＜0.001)。相反，C3-/-MSCs抑制MSCs迁移(P＜0.05vs.LvNull-MSCs)。为了进一步确定氧化应激的影响，我们测试了不同CM对H2O2诱导的MSCs细胞损伤的作用。当用H2O2诱导损伤时，与LvNull-MSCs的CM相比，来自LvC3-MSCs的CM增加MSCs的细胞活性(P＜0.001)，而来自C3-/-MS的CM减少MSCs活性(P＜0.001)。事实上，hCTRP3蛋白直接处理也能刺激MSCs产生相同的生物学行为，hCTRP3蛋白呈浓度依赖的方式促进MSCs迁移(P＜0.05，P＜0.001)、减轻H2O2诱导的MSCs凋亡(P＜0.01vs.H2O2)和坏死(P＜0.01vs.H2O2)。另外，与CM培养时不同的是，hCTRP3处理72h还能促进MSCs增殖(P＜0.01)。
5.CTRP3上调细胞保护蛋白SOD2和MT1/2，并增加MMP9分泌。为了进一步研究CTRP3对MSCs调节作用的分子机制，我们检测了MSCs生物功能相关的的66种mRNA的水平(包括增殖，迁移，凋亡/死亡，旁分泌信号，血管生成，抗氧化作用，线粒体功能，多能性和多细胞分化)。CTRP3处理48h后，通过qPCR和WesternBlot检测MSCs的mRNA和蛋白质水平。结果显示CTRP3上调细胞周期蛋白A2(CCNA2)，细胞周期蛋白B1(CCNB1)，核仁和纺锤体相关蛋白1(NUSAP1)，MMP3，MMP9，MT1，MT2和SOD2的mRNA表达(均P＜0.001)。此外，蛋白水平上，CTRP3增加了抗氧化蛋白SOD2(P＜0.01)和MT1/2的表达(P＜0.05)。CTRP3还可上调MMP9蛋白表达(P＜0.05)并增强MMP9活性(P＜0.01)。
6.ERK1/2信号通路激活增强CTRP3介导的促MSCs增殖，迁移和细胞保护作用。CTRP3处理MSCs15min和30min后，检测各促生存激酶的激活情况。结果显示CTRP3对AMPK，AKT和JNK1/2信号通路的表达激活没有影响，但是激活ERK1/2通路(P＜0.001,CTRP330minvs.vehicle30min)，应用ERK1/2通路抑制剂U0126后发现，U0126处理可降低CTRP3诱导的MMP9表达(P＜0.01vs.DMSO+CTRP3)，并完全阻断了CTRP3诱导的抗氧化蛋白SOD2(P＜0.05vs.DMSO+CTRP3)和MT1/2的上调(P＜0.001vs.DMSO+CTRP3)。此外，抑制ERK12信号通路后，CTRP3诱导的MSCs增殖(P＜0.01vs.DMSO+CTRP3)，迁移(P＜0.001vs.DMSO+CTRP3)和细胞保护(P＜0.01vs.DMSO+CTRP3)作用均被抑制。最后，我们研究了CTRP3-ERK1/2-MMP9轴是否在MSCs增殖的调节中起作用。用中和抗体阻断MMP9后，CTRP3诱导的MSCs增殖作用消失(P＜0.01)。
【研究结论】
1.本研究证明MSCs在体内外表达并分泌CTRP3，氧化损伤显著降低MSCs中CTRP3的表达和分泌，提示CTRP3可能参与调节MSCs生物学行为。
2.本研究首次发现MSCs可通过调节自身CTRP3表达，减少心肌细胞凋亡，抑制心脏病理性重塑和增加血管新生，改善MSCs对MI后心肌的保护作用。并首次揭示CTRP3介导MSCs在体内缺血微环境中生存率显著增加，可能是改善MSCs疗效的重要原因。
3.本研究首次证实MSCs能通过自分泌CTRP3调节自身的迁移和抗氧化损伤。其机制主要是：①CTRP3激活ERK1/2-SOD2-MT1/2通路抗氧化应激诱导的细胞损伤；②CTRP3激活ERK1/2-MMP9通路促细胞增殖和迁移。
缺血性心脏病发病率和死亡率高，严重威胁人类的健康。过去缺血性心脏病主要的死因是急性心梗及其并发症。但是随着介入、架桥等血管再通和心脏辅助技术的发展，心梗的急性期死亡率显著下降，而继发于心梗的病理性心肌重构往往预后不良，导致严重的心衰，目前其死亡人数远远超过急性心肌梗死，已经成为了缺血性心脏病患者死亡的首要原因。因此如何有效地干预心梗后病理性心肌重构成为亟待解决的问题。
心肌梗死(myocardial infarction，MI)后，坏死的心肌细胞被瘢痕组织所取代，而不具有收缩功能的瘢痕组织会进一步引起梗死面积扩大，最终使心室扩张成球形，是心梗后心脏发生病理性心肌重构，最终走向心衰的主要病理生理改变。间充质基质细胞(mesenchymal stromal cells, MSCs)移植是治疗心梗后病理性心肌重构有效的治疗方案。研究表明，MSCs能通过旁分泌细胞因子、外泌体或者通过细胞间线粒体转移等多种机制改善心肌梗死后心脏的功能和结构。然而，临床研究证实MSCs疗效并没有动物模型显著，可能的原因是MSCs在缺血缺氧等微环境中急速凋亡和存活不良。通过遗传修饰增强MSCs的抗损伤能力被认为是改善MSCs存活和定植的有效手段。
C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白-3(CTRP3)是一种新近发现的脂肪因子，我们课题组前期报道CTRP3能抑制MI后心脏的病理性重构，并且我们的预实验证实MSCs表达和分泌CTRP3，且在损伤应激下，MSCs表达和分泌CTRP3明显下降。但是CTRP3是否是MSCs的细胞保护因子，通过基因修饰CTRP3改造MSCs是否能改善MSCs的心肌保护作用，目前尚不清楚。本研究通过基因干预手段高表达或低表达CTRP3后，观察MSCs对MI疗效的影响，并进一步探讨可能的机制。
【研究目的】
1.分离培养和纯化骨髓MSCs，检测MSCs表达分泌CTRP3的情况，并探索过氧化氢损伤对MSCs表达分泌CTRP3的影响。
2.通过慢病毒体外感染构建CTRP3高表达或低表达的MSCs，体内移植后观察不同CTRP3表达水平的MSCs对MI小鼠心脏功能、左室重构和血管新生的影响，并分析不同组MSCs在体内的生存和定植情况。
3.通过细胞共培养探讨CTRP3表达水平对MSCs自身生物学行为的影响，并探讨可能的分子机制。
【研究方法】
1.实验动物：1)8周龄C57BL/6J雄性小鼠由空军军医大学实验动物中心提供；2)CTRP3基因敲除鼠(CTRP3-KO)小鼠由K&D基因科技有限公司(武汉,中国)构建。
2.基因干预：1)慢病毒过/低表达MSCs中CTRP3:GFP标记的CTRP3慢病毒(LvCTRP3)和空载对照慢病毒(LvNull)均由上海吉凯基因科技有限公司构建；GFP标记的CTRP3-shRNA慢病毒(LVshC3)和对照Lv3-NC慢病毒(Lvshctrl)由上海吉玛基因科技有限公司构建。将第四代(P4)MSCs培养至40-50％汇合，然后以50的感染复数感染细胞48h。通过用荧光显微镜计数GFP阳性的细胞来评价感染效率，通过WesternBlot检测慢病过表达和低表达效率。
3.在体研究：1)建立C57BL/6J小鼠MI模型：8周龄C57BL/6J雄性小鼠经2%异氟烷麻醉，在左侧胸壁3-4肋间做1cm斜行切口，暴露心脏后顺势将心脏挤出，找出心脏冠状动脉左前降支，在左心耳下缘2mm处用6-0丝线结扎。2)MI模型建立后，立刻在心肌梗死周边三点注射25μLPBS或不同组别MSCs。研究CTRP3过表达时，分组如下：①MI+PBS(n=20)；②MI+MSCs(n=22)；③MI+LvC3-MSCs(n=26)；④MI+LvNull-MSCs(n=19)。当研究CTRP3低表达，分组如下：①MI+PBS(n=20)；②MI+MSCs(n=20)；③MI+LvShC3-MSCs(n=20)；④MI+Lvshctrl-MSCs(n=20)，然后分别行相关指标检测。3)超声心动图检测：MI后第1，7和28天，用Visualsonicvevo2100高分辨率小动物在体超声成像系统，记录动物超声心动图，计算LVEF。4)MI第28天的心脏标本用4％多聚甲醛固定过夜并包埋后，将心脏冠状切片至5μm厚，行Masson染色，通过ImageJ软件测量心脏纤维化程度。4)心肌细胞凋亡检测：MI后4周，使用TUNEL试剂盒染色心脏石蜡切片，通过计数凋亡细胞数量定量分析心肌细胞凋亡。5)免疫荧光染色分析梗死周围细胞成分：MI后4周心脏组织OCT包埋固定切片，分别进行vWF、α-SMA和vimentin染色，采集荧光照片，计算血管新生和纤维细胞数量。6)MSCs体内监测：MI后第1,7和14天心脏标本制备8μm厚冷冻切片，免疫荧光分析GFP阳性细胞比率。
4.体外实验：1)MSCs的鉴定：流式细胞术分析表面标记分子CD29、CD34、CD44、CD45；体外诱导分化实验评估MSCs的脂肪形成和成骨分化潜能。2)迁移实验：共培养迁移实验中，MSCs接种在transwell小室内，接收孔接种MSCs，LvC3-MSCs，LvNull-MSCs或C3-/-MSCs(CTRP3-KO)。CTPP3蛋白直接作用时，MSCs接种在transwell小室内，接收孔加入不同浓度的hCTRP3，24h后结晶紫染色，光镜下计数迁移细胞数量。4)细胞增殖和活性检测：①为评估MSCs，LvC3-MSCs，LvNull-MSCs或C3-/-MSCs来源的条件培养基(conditioned medium， CM)处理的MSCs的增殖和氧化损伤情况，将MSCs，LvC3-MSCs，LvNull-MSCs或C3-/-MSCs接种在培养皿，24h后收集CM。为了检测细胞增殖能力，将MSCs与不同CM共培养；为了检测抗氧化活性，将MSCs与不同CM和400μMH2O2一起孵育24h。②细胞增殖或活性检测：将细胞与10％CCK-8溶液温育2-4h后使用微孔板分光光度计在450nm处检测吸光度。4)流式细胞仪检测细胞凋亡：V-FITC和PI染色后，使用流式细胞仪定量检测凋亡细胞。5)LDH释放实验：收集细胞上清液，并使用LDH细胞毒性测定试剂盒，根据制造商的说明进行检测。6)RT-PCR筛选：MSCs经CTRP3蛋白孵育24h后，检测66个与MSCs增殖、迁移、氧化、凋亡等功能相关基因的表达。6)凝胶酶谱法检测MMPs活性：MSCs经CTRP3蛋白孵育24h后，收集细胞培养液，离心浓缩后，在含有1%SubstrateG的凝胶中电泳后用考马斯亮蓝染液染色凝胶，脱色液处理后采集凝胶图片，Bio-Rad软件定量分析MMP9活性。7)Westernblot检测CTRP3、CCNA2、CCNB1、Nusap1、MMP3、MMP9、MT1/2、SOD2、pAKT、AKT、pERK1/2、ERK1/2、p-AMPK、AMPK、p-JNK、JNK和GAPDH蛋白表达。
5.统计分析：所有数据均表示为n个独立实验的平均值±标准差。使用GraphPadPrism-6统计软件(La Jolla，CA，USA)分析数据。通过非配对的双尾t检验分析两组之间的差异。使用单因素方差分析(ANOVA)，然后使用Bonferroni事后检验来比较三组或多组差异。通过Kaplan-Meier方法进行生存率分析，然后进行对数秩检验。时间和组间差异通过双因素方差分析检验，然后进行事后检验。P值小于0.05被认为具有统计学差异。
【研究结果】
1.从小鼠骨髓中分离的细胞表现MSCs特征，并且H2O2处理下调了MSCs中CTRP3的表达和分泌。小鼠骨髓来源的P4代单核细胞形态均一，似纺锤体。流式细胞术分析显示，培养的MSCs表达标记分子CD29和CD44，但不表达CD34和CD45。MSCs能在体外被诱导诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。RT-PCR和蛋白质印迹结果表明MSCs在正常培养条件下表达CTRP3，而H2O2处理减少MSCs中CTRP3mRNA表达(P＜0.001)和蛋白表达水平(P＜0.01)，抑制CTRP3分泌(P＜0.01)。
2.CTRP3过表达的MSCs可改善MI小鼠的生存率，恢复左心室心功能和抑制心脏病理性重塑，此效应与CTRP3-MSCs在MI区域的存活率增加有关。1)LvC3-MSCs或LvNull-MSCs通过心肌内注射移植到左心室梗死边界区。在细胞注射后7天检测心脏组织蛋白表达证实LvC3-MSCs组梗死边界区CTRP3表达水平明显增高(依次P＜0.01vs.MI+LvNull-MSCs;P＜0.05vs.MI+MSCs)。MI+PBS组小鼠4周后生存率45％，而LvC3-MSCs组小鼠存活率进一步增加至84％(P＜0.05vs.MI+PBS)。在MI后第1,7和28天用超声心动图分析评估左心室心脏功能。MI后第1天各组LVEF没有差异。然而在MI后第7天，与MI+PBS组相比，MI+MSCs和MI+LvNull-MSCs组小鼠LVEF显著改善(均P＜0.05)。此外，在MI后第7天和第28天,较MI+LvNull-MSCs组，LvC3-MSCs组LVEF进一步增加(依次P＜0.01，P＜0.001)；MI后28天的大体解剖和Masson染色结果表明，与MI+PBS组相比，MSCs可降低心脏大小/质量比值(P＜0.01)，增加心肌细胞/纤维化细胞比率(P＜0.01)和减轻间质纤维化(P＜0.05)。而MI+LvC3-MSCs组进一步抑制MI后病理性心脏重塑(均P＜0.05vs.MI+LvNull-MSCs)；Tunel染色结果证实LvC3-MSCs组心肌细胞凋亡显著下降(P＜0.01vs.MI+MSCs)；vWF和αSMA免疫组织化学染色结果表明与注射PBS相比，心脏梗死边缘区注射MSCs后的毛细血管(P＜0.05)和小动脉的密度(P＜0.01)增加。而与MI+LvNull-MSCs组相比，注射LvC3-MSCs组的心脏毛细血管(P＜0.05)和小动脉(P＜0.01)新生进一步增加。通过免疫荧光显微镜分析移植后第1,7和14天心脏中MSCs存活情况，结果显示GFP标记的MSCs在注射部位周围呈簇样分布，并且仅在有限时间内存活。在MI后第1天，LvC3-MSCs和LvNull-MSCs移植细胞数量无显著差别，而在MI后7天LvC3-MSCs组GFP阳性细胞数量明显较多(P＜0.01)。另外，仅有非常小比例MSCs分化为内皮细胞，并且在LvC3-MSCs和LvNull-MSCs组之间内皮细胞分化数量无显著差异(P＞0.5)。同时我们未发现MSCs向血管平滑肌细胞分化。
3.沉默CTRP3表达可损害MSCs对心脏功能和左心室心脏重塑的保护作用。在MI后28天，CTRP3敲低可减弱MSCs对心脏射血功能的恢复作用(P＜0.01vs.MI+Lvshctrl-MSCs)。此外，与Lvshctrl-MSCs组相比，LvshC3-MSCs不仅增加心脏纤维化(P＜0.01)和间质纤维化(P＜0.05)，而且还减少MI边界区毛细血管密度(P＜0.05)和小动脉密度(P＜0.001)。进一步评估各组MSCs的存活，结果显示与Lvshctrl-MSCs组相比，LvshC3-MSCs组MSCs的存活数量减少(P＜0.01)。
4.MSCs分泌的CTRP3诱导MSCs迁移并保护MSCs抵抗H2O2诱导的细胞凋亡。CCK-8结果显示，与来自MSCs的CM相比，在处理后48h，LvC3-MSCs的CM和C3-/-MSCs的CM都没有对MSCs增殖产生影响。共培养实验表明，与LvNull-MSCs相比，LvC3-MSCs促进MSCs迁移(P＜0.001)。相反，C3-/-MSCs抑制MSCs迁移(P＜0.05vs.LvNull-MSCs)。为了进一步确定氧化应激的影响，我们测试了不同CM对H2O2诱导的MSCs细胞损伤的作用。当用H2O2诱导损伤时，与LvNull-MSCs的CM相比，来自LvC3-MSCs的CM增加MSCs的细胞活性(P＜0.001)，而来自C3-/-MS的CM减少MSCs活性(P＜0.001)。事实上，hCTRP3蛋白直接处理也能刺激MSCs产生相同的生物学行为，hCTRP3蛋白呈浓度依赖的方式促进MSCs迁移(P＜0.05，P＜0.001)、减轻H2O2诱导的MSCs凋亡(P＜0.01vs.H2O2)和坏死(P＜0.01vs.H2O2)。另外，与CM培养时不同的是，hCTRP3处理72h还能促进MSCs增殖(P＜0.01)。
5.CTRP3上调细胞保护蛋白SOD2和MT1/2，并增加MMP9分泌。为了进一步研究CTRP3对MSCs调节作用的分子机制，我们检测了MSCs生物功能相关的的66种mRNA的水平(包括增殖，迁移，凋亡/死亡，旁分泌信号，血管生成，抗氧化作用，线粒体功能，多能性和多细胞分化)。CTRP3处理48h后，通过qPCR和WesternBlot检测MSCs的mRNA和蛋白质水平。结果显示CTRP3上调细胞周期蛋白A2(CCNA2)，细胞周期蛋白B1(CCNB1)，核仁和纺锤体相关蛋白1(NUSAP1)，MMP3，MMP9，MT1，MT2和SOD2的mRNA表达(均P＜0.001)。此外，蛋白水平上，CTRP3增加了抗氧化蛋白SOD2(P＜0.01)和MT1/2的表达(P＜0.05)。CTRP3还可上调MMP9蛋白表达(P＜0.05)并增强MMP9活性(P＜0.01)。
6.ERK1/2信号通路激活增强CTRP3介导的促MSCs增殖，迁移和细胞保护作用。CTRP3处理MSCs15min和30min后，检测各促生存激酶的激活情况。结果显示CTRP3对AMPK，AKT和JNK1/2信号通路的表达激活没有影响，但是激活ERK1/2通路(P＜0.001,CTRP330minvs.vehicle30min)，应用ERK1/2通路抑制剂U0126后发现，U0126处理可降低CTRP3诱导的MMP9表达(P＜0.01vs.DMSO+CTRP3)，并完全阻断了CTRP3诱导的抗氧化蛋白SOD2(P＜0.05vs.DMSO+CTRP3)和MT1/2的上调(P＜0.001vs.DMSO+CTRP3)。此外，抑制ERK12信号通路后，CTRP3诱导的MSCs增殖(P＜0.01vs.DMSO+CTRP3)，迁移(P＜0.001vs.DMSO+CTRP3)和细胞保护(P＜0.01vs.DMSO+CTRP3)作用均被抑制。最后，我们研究了CTRP3-ERK1/2-MMP9轴是否在MSCs增殖的调节中起作用。用中和抗体阻断MMP9后，CTRP3诱导的MSCs增殖作用消失(P＜0.01)。
【研究结论】
1.本研究证明MSCs在体内外表达并分泌CTRP3，氧化损伤显著降低MSCs中CTRP3的表达和分泌，提示CTRP3可能参与调节MSCs生物学行为。
2.本研究首次发现MSCs可通过调节自身CTRP3表达，减少心肌细胞凋亡，抑制心脏病理性重塑和增加血管新生，改善MSCs对MI后心肌的保护作用。并首次揭示CTRP3介导MSCs在体内缺血微环境中生存率显著增加，可能是改善MSCs疗效的重要原因。
3.本研究首次证实MSCs能通过自分泌CTRP3调节自身的迁移和抗氧化损伤。其机制主要是：①CTRP3激活ERK1/2-SOD2-MT1/2通路抗氧化应激诱导的细胞损伤；②CTRP3激活ERK1/2-MMP9通路促细胞增殖和迁移。