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【研究目的】1.探讨入核受体抑制剂Importazole (IPZ)对多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)细胞生物学特性的影响及其可能的作用机制。2.探讨维甲酸衍生物Fenretinide对MM侧群细胞生物学特性的影响及其可能的作用机制。【研究方法】一、入核受体抑制剂Importazole对多发性骨髓瘤细胞生物学特性的影响1.通过免疫荧光技术观察骨髓瘤细胞系、原代细胞及正常人单个核细胞NF-κB、Importin β的表达和定位。2.不同浓度IPZ处理骨髓瘤RPMI8226、NCI-H929、LP-1、SKO-007、KMS11、原代细胞、正常人单个核细胞，用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色法检测细胞的活力；流式细胞术测定细胞周期和细胞凋亡。Western blot(WB)法检测细胞核内NF-κB的蛋白表达。电泳迁移位移实验(electrophoretic mobility shiftassay,EMSA)检测核内NF-κB的DNA结合活性。RT-PCR检测NF-κB信号通路下游靶基因的变化。3.干扰Importin β后WB检测干扰效率，免疫荧光观察NF-κB在细胞中的定位，流式细胞术检测细胞凋亡。二、维甲酸衍生物Fenretinide对多发性骨髓瘤侧群细胞生物学特性的影响。1．用不同浓度Fenretinide处理骨髓瘤RPMI8226、NCI-H929、LP-1、SKO-007、KMS11、原代细胞、正常人单个核细胞，用MTT法检测细胞的活力，流式细胞术检测细胞凋亡。2．基于侧群(side population, SP)细胞对核染料(Hoechst33342)的排斥反应，借助流式细胞仪检测Fenretinide、硼替佐米、地塞米松（单用及合用）处理后NCI-H929SP细胞比例的变化。3．分选NCI-H929SP和主群(main population, MP)细胞，将分选后的SP和MP细胞分别予Fenretinide、硼替佐米、地塞米松（单用及合用）处理，用MTT法检测细胞的活力，流式细胞术检测细胞周期和凋亡。4．集落形成实验检测Fenretinide单用或与硼替佐米、地塞米松联合用药对SP细胞集落形成能力的影响。5．检测Fenretinide对SP和MP细胞活性氧的影响。【研究结果】一、入核受体抑制剂Importazole对多发性骨髓瘤细胞的影响1. Importin β在多发性骨髓瘤原代细胞中高表达。2.干扰NCI-H929细胞Importin β表达后可抑制NF-κB入核并诱导细胞凋亡。3. IPZ呈时间浓度依赖方式抑制骨髓瘤RPMI8226、NCI-H929、LP-1、SKO-007、KMS11细胞增殖及诱导凋亡。4.8μM IPZ分别作用RPMI8226和NCI-H929细胞24h，可以诱导S期细胞分别由(53.55±0.94)％、(52.42±1.16)％减少至(45.19±1.62)％、(42.27±1.02)％；明显抑制NF-κB入核进而影响其与DNA的结合活性。同样浓度IPZ作用于CD138+骨髓瘤原代细胞2h可即可抑制NF-κB入核，16h可显著诱导细胞凋亡。但对正常人骨髓单个核细胞的诱导凋亡作用并不明显，与不加药组对比，无统计学差异。5. IPZ可抑制骨髓瘤原代细胞NF-κB信号通路下游靶基因BCL-2、C-IAP1、XIAP的表达。二、维甲酸衍生物Fenretinide对多发性骨髓瘤侧群细胞的影响。1．Fenretinide呈浓度依赖方式抑制RPMI8226、 NCI-H929、LP-1、SKO-007、KMS11细胞的增殖。2．Fenretinide单用或与硼替佐米、地塞米松合用可明显降低NCI-H929SP细胞的比例(p<0.05)。3．经分选后的SP细胞周期主要处于G0/G1期，而MP细胞主要处于S期与G2期。4．硼替佐米、地塞米松单用与合用对骨髓瘤SP细胞无明显杀伤作用。Fenretinide单用或与硼替佐米、地塞米松合用可诱导SP细胞凋亡。5．SP细胞的集落形成能力强于MP细胞，硼替佐米和地塞米松对NCI-H929SP细胞的集落形成能力影响不大，而Fenretinide及含Fenretinide的联合用药均可显著降低NCI-H929的SP细胞的集落形成能力。6．Fenretinide通过促使细胞产生活性氧诱导细胞凋亡。【研究结论】1．入核受体抑制剂IPZ通过抑制P65入核，阻断激活的NF-κB信号通路，从而抑制多发性骨髓瘤细胞增殖并诱导凋亡。2．多发性骨髓瘤临床一线用药硼替佐米与地塞米松对骨髓瘤SP细胞杀伤作用不明显，Fenretinide可通过促使细胞产生活性氧影响SP细胞的生物学特性，与硼替佐米和地塞米松合用后可显著诱导SP细胞凋亡。