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肌肉生长抑制素(MSTN)是特异性骨骼肌生长发育负调控因子,其活性的丧失或降低,会引起动物肌肉的过度发育,牛MSTN基因的自然突变会引发“双肌”现象。相对于自然杂交育种来说,通过基因打靶技术制备转基因动物具有育种周期短、遗传性状稳定等特点。本研究针对牛MSTN基因,构建同源重组打靶载体,对牛胎儿成纤维细胞实施电转染,进而用同源重组阳性细胞通过体细胞核移植技术制备牛MSTN基因敲除胚胎,并进行胚胎移植获得妊娠母牛。本研究结果可为优良家畜的生产及MSTN基因的功能研究奠定基础。1.牛MSTN基因敲除打靶载体的构建构建两套用于牛MSTN基因敲除的置换型打靶载体pPLP-MSTN和PⅢ-MSTN。pPLP-MSTN为常规同源重组打靶载体,包含2.8kb同源短臂和4.0kb同源长臂,具有含PGK启动子的Neor基因作为正筛选标记；载体PⅢ-MSTN为绿色荧光蛋白启动子捕获打靶载体,包含1.3kb同源短臂和6.8kb同源长臂,具有无启动子的绿色荧光蛋白基因和含PGK启动子的Neor基因作为双正筛选标记。两套打靶载体的同源臂均克隆自和牛耳组织细胞。2. MSTN基因敲除牛胎儿成纤维细胞的制备利用线性化打靶载体pPLP-MSTN电击转染大连雪龙黑牛、和牛与鲁西黄牛的胎儿成纤维细胞,经G418筛选共获得了363个G418抗性克隆,经PCR鉴定没有发生同源重组的阳性克隆；利用线性化打靶载体PⅢ-MSTN电击转染和牛与鲁西黄牛的胎儿成纤维细胞,经G418筛选分别获得了104和164个G418抗性克隆,经荧光显微镜镜检分别获得了20和29个具有抗性的绿荧光克隆。通过PCR鉴定与测序分析,在20个有抗性的绿荧光和牛细胞克隆中,获得一个表达绿色荧光的MSTN基因敲除克隆,相对打靶效率为5.00%(1/20),绝对打靶效率为0.27×10-7(1/3.4×107)；在29个有抗性的绿荧光鲁西黄牛细胞克隆中,没有发现同源重组的阳性克隆。3. MSTN基因敲除牛胚胎的制备与移植以基因敲除的牛胎儿成纤维细胞为核供体,利用核移植技术制备牛MSTN基因敲除胚胎。本研究采去核操作卵母细胞370枚,用于融合的重构胚为363枚,融合259枚,融合率为71.3%；发育培养后获得66枚囊胚,囊胚率为25.5%。将18枚胚胎移入12头受体,3头妊娠,妊娠率为25%。