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聚己内酯(PCL)是由ε-己内酯聚合而成的高分子聚酯材料,能够在自然界中被微生物分泌的解聚酶完全降解。本实验室在前期研究中筛选了一株对PCL具有高效降解作用的菌株Pseudomonas sp.DS1001,该菌株能够产生多种对PCL具有降解作用的解聚酶。实验室前期已获得一种分子量为28.4kDa的PCL解聚酶I。本研究通过重新对该菌的发酵液进行分离纯化,优化了PCL解聚酶I的纯化流程,并获得了与PCL解聚酶I具有明显差别的PCL解聚酶Ⅱ,对其酶学性质进行了检测,对该酶的基因进行了克隆和序列分析,同时探讨了该酶对PCL的降解过程,为更好地阐述PCL的降解机制奠定了基础,具体研究内容及结果如下。(1)通过离子交换柱层析和分子筛层析纯化得到了PCL解聚酶I和PCL解聚酶Ⅱ,其中,PCL解聚酶I的纯化倍数为5.02,回收率为18.69%,PCL解聚酶Ⅱ的纯化倍数为4.01,回收率为12.93%。对PCL解聚酶Ⅱ的SDS-PAGE检测显示其分子量大小约为32.79kDa。(2)对PCL解聚酶Ⅱ的酶学性质进行了研究,结果显示该酶的最适反应温度为40℃,在20℃-60℃的范围内温度稳定性良好;该酶的最适反应pH为10.0,在pH6.0-12.0的范围内具有较好的稳定性;金属离子对酶活性具有不同程度的影响,在金属离子浓度为1mM时,Zn2+离子能够抑制酶活性,Mg2+、Na+、Ca2+以及Co2+等离子能够不同程度的提高酶活性;EDTA和PMSF对酶活性具有明显的抑制作用;Triton X-100和Tween-80强烈抑制酶活性;该酶对甲醇、乙醇和甘油等有机溶剂的耐受性良好。(3)对PCL解聚酶Ⅱ的底物特异性进行了研究,结果表明该酶对脂肪族聚酯PBS、PHB及三丁酸甘油酯和不同碳链长度的pNP酯均具有降解活性;但对PLA和苹果皮粗角质无降解活性;分别以三丁酸甘油酯和pNPC6为底物,能够检测到PCL解聚酶Ⅱ的脂肪酶“界面激活”效应。(4)对PCL解聚酶Ⅱ的基因进行了克隆,并在E.coli BL21中实现了异源表达。利用预测软件对重组酶Pclase Ⅱ的理化性质和结构进行了分析,结果显示,Pclase Ⅱ由317个氨基酸构成,理论分子量为33.1994kDa,理论等电点为6.59;其N端可能含有一个由25个氨基酸残基组成的信号肽序列,30-316位氨基酸具有α/β水解酶家族的保守序列;与其氨基酸序列相似性较高的蛋白多来源于Pseudomonas sp.的脂肪酶;二级结构中,无规则卷曲占53.94%,α-螺旋和β-折叠分别占36.90%和9.14%;以Pseudomonas aeruginosa PAO1的脂肪酶的PAL(1ex9.1.A)为模板进行了三维模建,推测Pclase Ⅱ三维结构中存在一个与其“界面激活”效应相关的可移动的α-螺旋“盖子结构”。(5)对PCL解聚酶Ⅱ的降解PCL的机制进行研究,实验结果表明,其对PCL乳化底物的降解终产物为羟基己内酯单体、二聚体、三聚体和四聚体,在不完全降解阶段,还存在五聚体和六聚体。PCL膜片降解速率呈现先慢后快的趋势;SEM结果显示,随着酶解作用的进行,PCL的非结晶区优先降解,之后为球状结晶区,球晶的降解从中心开始,并逐渐向外周扩展。