研究背景和目的临床上因先天性畸形、外伤及肿瘤切除术等各种原因造成的大体积软组织缺损一直是整形修复外科面临的重大挑战之一。2011年美国有近5百万例的修复重建手术,78%为修复重建肿瘤切除术后的软组织缺损。全球范围内每年大约有130万乳腺癌新病例,乳癌切除后必将造成大范围的软组织缺损。手术治疗这类软组织缺损的目的不仅仅是为了填充凹陷,更重要的是要形成具有自然外观和美学功能、与身体周围组织结合并长期维持稳定的自然组织。传统的乳房再造的手术方案多采用自体皮瓣或脂肪瓣转移修复。术后都不可避免地造成供区不可逆的畸形与疤痕。因此能够构建定形状、定体积、可供移植的软组织瓣成为了临床医师的“终极梦想”。脂肪组织工程技术为解决软组织缺损的修复提出了全新的思路。1999年Patrick利用前脂肪细胞在聚乳酸乙醇酸材料上成功构建出脂肪组织,通过将特异性种子细胞种植于生物活性支架材料上,通过种子细胞和材料的相互作用促进细胞的增殖和分化,首先实现了在体内外构建工程化脂肪组织的尝试。但直至近期的报道,不管是通过优化种子细胞或者改性生物活性材料或者改善局部微环境,最终构建的工程化脂肪组织,其体积都没有超过1ml,并且在组织构成和组织稳定上都难以达到满意的结果。随着深入的研究,目前认为组织工程化脂肪组织的体积主要取决于：①构建物早期的快速血管化,这是限制组织工程技术最终构建物体积以及组织结构成熟的关键因素；②可随构建物动态发展、可控降解、组织相容性良好的生物材料；③符合构建物发生发展的生长因子梯度及微环境；④稳定的物理屏障以保障构建物体积和组织形态的长期稳定。对于如何促进早期构建组织的血管化这个关键问题,许多学者提出不同的实验方案,如局部加入促血管生长因子(VEGF、FGF、HGF等),病毒载体转染促血管生成基因,不同种子细胞共培养等,以使早期构建物尽快血管化；通过直接添加或者缓释技术等添加各种生长因子,但是目前为止都未能明显改善最终构建物的体积。针对这些关键因素,Hofer等人于2003年提出“组织工程室技术(Tissue Chamber Technique)"的概念,即采用生物惰性材料制作有一定硬度的保护性容器,将轴形血管或不同组织转移到其内部,为拟构建的组织提供血运基础、营养物质和生长所需空间,称为血管化组织工程室。这种创新型的构建模式思路为我们的组织工程研究大大拓宽了道路,通过引入在体的血管蒂,使移植物能够在早期获得充足的血供和营养,极大提高种子细胞的存活率。局限性的工程室能够将支持组织新生相关的生长因子限制在工程室室内,并随着组织的动态发展提供相应的变化,同时硬性的工程室外壳为新生物提供坚固的物理支撑,保障构建物的生长。这种新型的构建模式似乎相应地解决了传统组织工程化组织的体积大小受限的几个关键问题。但是脂肪组织本身具有很独特的生理结构,脂肪组织中除了丰富的血管网络之外,90%的空间由高耗氧、高耗能的脂肪细胞构成,同时作为机体重要的内分泌器官,脂肪组织能分泌多种脂肪因子,同时参与血管化和脂肪化的过程,单纯促进血管化能否构建出完整成熟的脂肪组织?脂肪组织内和脂肪组织周围的局部微环境是否影响最终新生构建物的组织形态和成熟程度?如何协调地促进血管化和脂肪化的相互作用?归根结底来说,就是如何利用组织工程室模型,阐明工程室内各种微环境对新生组织的影响,最终诱导大体积成熟工程化脂肪组织。围绕这几个科学问题,本实验先是研究了利用组织工程室模型和预构技术,通过加强早期血管化,观察外源性种子细胞在新生组织中的功能和最终的组织结构,探讨通过单纯促进血管化策略是否能构建出大体积的新生组织。而后通过对组织工程室内单纯成脂微环境和内环境的对比,揭示局部微环境对于构建大体积新生组织的影响。最后在工程室内植入带有轴形血管蒂的脂肪瓣诱导新生组织,探讨利用自体组织脂肪再生的相关机制。方法1、预构富血管工程化组织构建大体积新生组织的设想及实验证实通过利用组织工程室模型和预构技术,先构建出富血管化的支架载体,然后加入标记后脂肪组织特异性种子细胞SVF,通过观察新生组织的体积大小、组织形态、对种子细胞的功能进行评价,探讨促进局部血管化对于构建大体积新生组织的可能性。2、组织工程室内内环境诱导大体积脂肪组织新生利用组织工程室模型,通过在对工程室内内环境的检测,观察组织学形态、新生细胞来源、室内内环境动态变化,探讨室内局部内环境对于新生构建工程化组织的影响,证实单纯成脂微环境和局部内环境对大体积脂肪组织的诱导作用。3、组织工程室诱导大体积脂肪组织新生的构建策略将带有轴形血管蒂的脂肪瓣植入组织工程室内,不加入外源性种子细胞和生物支架,利用脂肪瓣内成熟的血管化和脂肪化,通过在工程室内同时提供血管化和成脂化的微环境,进行大体积脂肪组织的新生诱导,并通过连续时间点的组织学观察和相关因子检测初步探讨工程室诱导脂肪组织新生的相关机制。4、统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示,使用统计软件SPSS13.0进行数据处理。两组之间比较采用配对t检验;不同时间点的差异采用协方差分析。结果1、利用组织工程室和单纯血管蒂能够诱导出大于lml的以富血管化纤维结缔组织为主的新生组织,加入脂肪组织特异性外源性种子细胞,成功构建出1.1ml的新生组织,组织结构主要是纤维结缔组织,可见大量新生血管,但未见到明显脂肪组织结构。2、在工程室内单纯添加成脂诱导环境,最终形成的新生组织以纤维结缔组织为主,未见明显血管形成。不添加任何外源性干预因素的情况下,利用组织工程室,发现术后两个月,小室内可见明显组织新生形成凸起,组织学染色证实为成熟脂肪组织。室内组织液中细胞数目15天为最高,45天至60天趋于稳定,VEGF及MCP-1水平随时间变化逐渐降低,最终趋于稳定,各时间点之间不存在显著性性差异。在血管周发现CD34和围脂滴蛋白双阳性细胞,提示有间充质干细胞在室内进行分化成熟。但是最后形成的新生组织体积小并且局限于包膜内。3、在工程室内植入带有轴形血管蒂的脂肪瓣,4周后成功构建出3.03ml新生组织,组织学染色发现新生组织最外侧可见一薄层纤维包膜,较为致密,厚度均一,原生组织与新生组织未见明显区别,整个组织可见大量单房脂肪细胞聚集成团,纤维束将其分割成大量小叶样组织,中间可见大量血管分布,管腔中央有红细胞提示为成熟通畅血管。新生构建物同正常脂肪组织脂肪小叶结构相似。通过连续时间点观察发现新生组织存在动态变化的重塑过程。早期主要以大量单房脂肪细胞增生、自组装纤维蛋白原基质的沉积以及炎性反应为主,并不伴有血管的长入。而后出现血管长入,后期主要是新生组织中脂肪细胞、血管和细胞外基质进行动态重塑,最终形成具有标志性脂肪小叶的成熟脂肪组织。讨论目前临床上修复大体积软组织缺损主要是自体皮瓣和脂肪瓣转移法,术后都不可避免地造成供区不可逆的畸形与疤痕。利用传统的组织工程三要素很难获得大体积成熟脂肪组织,关键在于诱导过程中不能满足血管化和脂肪化的协调发展,早期血供的延迟成为构建大体积工程化脂肪组织的瓶颈。2003年“组织工程室”概念的提出为解决这个问题提供了新的视角。组织工程室可以在早期通过组织创伤释放的生长因子作用下由在体血管蒂迅速促进新生血管网的成熟；并且在室内局部富集生长因子和细胞因子,为室内内容物的生长提供稳定的内环境；具有一定硬度的工程室能够为室内容物的生长提供稳定的物理支撑,改变新生组织所处的力学环境,为大体积脂肪组织的诱导新生提供了可行的思路。但是鉴于脂肪组织结构的特殊性,组织工程室模型中真正能影响大体积成熟脂肪组织构建的决定因素至今尚不清楚,这样影响了大体积工程化脂肪组织的构建策略。脂肪组织的增长需要丰富的血管网络和局部成脂微环境的同时存在,这是间充质干细胞进行分化的必要条件,只有是血管化和成脂化相互协调发展,才能最终保证大体积成熟脂肪组织的构建成功。通过我们的实验,将单纯血管束植入工程室内,最终能得到了大于1ml的富血管化新生组织,但其组织类型主要以纤维结缔组织为主。在这个室内富血管床中添加脂肪组织特有的SVF细胞,最终形成的新生组织可见大量的血管,但是结构依然为纤维结缔组织,未见到明显实质组织结构。可见在缺少相应成脂微环境的诱导,即使特异性的外源性干细胞能在早期获得充足的血供,但由于微环境的缺乏依然不能自主分化形成脂肪细胞,导致难以对工程化组织的组织形态实现定向控制,不能构建出大体积的新生脂肪组织。单纯在室内加入脂肪组织块作为成脂微环境,最终因为缺少血液的供应,新生组织依然为纤维结缔组织并缺少血管长入。通过室内内环境的连续观察,我们发现工程室内早期的组织渗出液中含有大量的生长因子和细胞成分,这些细胞主要分布于血管周围并且表达CD34和围脂滴蛋白双阳性,提示这些细胞可能来源于循环中的间充质干细胞成分,最终形成的脂肪细胞可能就是这些间充质干细胞在包膜内的成脂环境诱导下增殖分化而来。但是这中新生的组织远远体积较小,限制在包膜内,远远达不到临床上的要求。可见在缺少成血管和成脂诱导下,单纯依靠室内内环境,最终难以形成大体积可供移植的脂肪组织。通过在工程室内植入带有轴形血管蒂的脂肪瓣,同时成血管和成脂微环境完美结合,4周后即能得到3.03ml的成熟工程化脂肪组织,并且新生组织形状同工程室形状相似。通过连续时间点观察发现新生组织存在动态变化的重塑过程。早期首先出现的是大量单房脂肪细胞在自组装纤维蛋白原基质上增殖、分化,这个过程并不伴有血管的长入。而后才出现血管长入,后期主要是新生组织中脂肪细胞、血管和细胞外基质进行动态重塑,最终形成具有标志性脂肪小叶的成熟脂肪组织。这种大体积工程化脂肪组织构建策略的实现对于临床上各种不同部位、不同形式的大体积软组织缺损的修复提供了一种安全、稳定且有效地新途径。结论1、单纯通过促进血管化,只能构建出富血管化的纤维结缔组织,并不能诱导种子细胞的定向成脂分化,不能诱导大体积的脂肪组织新生。2、在缺乏血管化和成脂化的工程室内,难以短期形成大体积可供移植的脂肪组织,单纯提供成脂环境不能形成富血管化的成熟脂肪组织。3、将带有轴性血管蒂的脂肪瓣植入组织工程室内,不添加任何外源性种子细胞和支架,能够获得大体积的成熟脂肪组织,并且早期工程室内可能首先出现脂肪化,而后才有血管的长入。