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漆酶催化的底物种类广泛,因此在纸张漂白、生物修复、染料脱色、果汁与酒的澄清、纺织品的清洁和生物传感器等方面具有巨大的应用潜力。但是,目前限制漆酶广泛应用的重要因素是漆酶产量低,价格昂贵。为了解决这个问题,提高漆酶产量的一个可行办法就是进行漆酶基因的异源表达。本研究在从漆酶高产菌株白腐真菌TR16中克隆了漆酶基因TR161ac的基础上,对该基因在酵母表达系统及银耳芽孢表达系统中进行异源表达,取得的主要结果如下:1漆酶基因在毕赤酵母中的表达
1.1构建酵母表达载体
把漆酶基因TR161ac分别克隆到酵母表达载体pPIC3.5K和pPIC9K中,构建成两个漆酶表达载体pPIC3.5K-TR161ac和pPIC9K-TR161ac。两个表达载体均利用AOXI启动子启动漆酶基因的表达,前者采用漆酶本地信号肽引导漆酶进行分泌表达而后者是采用酵母的a因子信号肽。
1.2酵母转化子的筛选与鉴定
采用电击转化法将两个表达载体转化进入毕赤酵母GSll5感受态细胞,经过MD培养基和BMM培养基(含0.04%愈创木酚和0.3mmol CuS04)筛选得到表达漆酶的转化子GS115-3.5K-TR161ac和GS115-9K-TR161ac。
1.3酵母转化子产漆酶酶活比较
随机挑选两类转化子各12个在BMM液体培养基(含有0.3mml CuS04和0.8%丙氨酸(m/v)中,25℃摇瓶培养。转化子GS115-3.5K-TR161ac平均酶活产量比GS115-9K-TR161ac高,在各自所选取的12个转化子里面,转化子GS115-9K-TR161ac的最高酶活产量为372.5 U/L,酶活高峰出现在18天左右;转化子GS115-3.5K-TR161ac最高酶活产量为893U/L,酶活高峰出现在第15天左右。
1.4重组酶特性研究
采用超滤、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析和Sephadex G100凝胶柱层析对酵母发酵液进行分离纯化,SDS--PAGE电泳检测。结果表明:该重组漆酶表观分子量为65.4 Kda,与ABTS的最适反应温度为50℃,最适反应pH为3.0,在pH7.0-10.0之间较稳定。Km值为0.66 mmol/L。
2漆酶基因在银耳芽孢中的表达
2.1构建了银耳芽孢表达载体
把漆酶基因TR161ac替换表达载体pgLes-mfc上的mfc基因,构建成漆酶表达载体pgLes-nspTR161ac,该表达载体含有香菇gpd启动子、漆酶基因TR161ac及漆酶基因的本身信号肽。
2.2银耳芽孢转化子的筛选与鉴定
采用电击转化法将表达载体pgLes-nspTR161ac和pBgGl-hph(含有灵芝gpdl-Gl启动子及潮霉素抗性基因)共转化进入银耳芽孢TrOl感受态细胞,经过MA培养基和PDA培养基(含愈创木酚)筛选得到表达漆酶的转化子Tr01-pgLes-nspTR161ac。
2.3银耳芽孢转化子产漆酶酶活测定
随机挑选5个转化子在YPD液体培养基(含有0.3mmol CuS04和0.8%丙氨酸(m/v)中,25℃摇瓶培养。发酵液中未能检测到漆酶酶活。提取银耳芽孢总蛋白后,检测得到漆酶酶活,漆酶表达量为0.08 U/g鲜重细胞。
2.4重组漆酶特性研究
通过空白TR01与转化子总蛋白的SDS--PAGE电泳分析,推断银耳漆酶表观分子量为59 Kda。该漆酶与ABTS的最适反应温度为40℃,最适反应pH为4.5,在pH7.0时最稳定。Km值为0.48 mmol/L。