Tr16lac漆酶基因在酵母及银耳芽孢中的表达研究

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lifengxing0628
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
漆酶催化的底物种类广泛,因此在纸张漂白、生物修复、染料脱色、果汁与酒的澄清、纺织品的清洁和生物传感器等方面具有巨大的应用潜力。但是,目前限制漆酶广泛应用的重要因素是漆酶产量低,价格昂贵。为了解决这个问题,提高漆酶产量的一个可行办法就是进行漆酶基因的异源表达。本研究在从漆酶高产菌株白腐真菌TR16中克隆了漆酶基因TR161ac的基础上,对该基因在酵母表达系统及银耳芽孢表达系统中进行异源表达,取得的主要结果如下:1漆酶基因在毕赤酵母中的表达   1.1构建酵母表达载体   把漆酶基因TR161ac分别克隆到酵母表达载体pPIC3.5K和pPIC9K中,构建成两个漆酶表达载体pPIC3.5K-TR161ac和pPIC9K-TR161ac。两个表达载体均利用AOXI启动子启动漆酶基因的表达,前者采用漆酶本地信号肽引导漆酶进行分泌表达而后者是采用酵母的a因子信号肽。   1.2酵母转化子的筛选与鉴定   采用电击转化法将两个表达载体转化进入毕赤酵母GSll5感受态细胞,经过MD培养基和BMM培养基(含0.04%愈创木酚和0.3mmol CuS04)筛选得到表达漆酶的转化子GS115-3.5K-TR161ac和GS115-9K-TR161ac。   1.3酵母转化子产漆酶酶活比较   随机挑选两类转化子各12个在BMM液体培养基(含有0.3mml CuS04和0.8%丙氨酸(m/v)中,25℃摇瓶培养。转化子GS115-3.5K-TR161ac平均酶活产量比GS115-9K-TR161ac高,在各自所选取的12个转化子里面,转化子GS115-9K-TR161ac的最高酶活产量为372.5 U/L,酶活高峰出现在18天左右;转化子GS115-3.5K-TR161ac最高酶活产量为893U/L,酶活高峰出现在第15天左右。   1.4重组酶特性研究   采用超滤、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析和Sephadex G100凝胶柱层析对酵母发酵液进行分离纯化,SDS--PAGE电泳检测。结果表明:该重组漆酶表观分子量为65.4 Kda,与ABTS的最适反应温度为50℃,最适反应pH为3.0,在pH7.0-10.0之间较稳定。Km值为0.66 mmol/L。   2漆酶基因在银耳芽孢中的表达   2.1构建了银耳芽孢表达载体   把漆酶基因TR161ac替换表达载体pgLes-mfc上的mfc基因,构建成漆酶表达载体pgLes-nspTR161ac,该表达载体含有香菇gpd启动子、漆酶基因TR161ac及漆酶基因的本身信号肽。   2.2银耳芽孢转化子的筛选与鉴定   采用电击转化法将表达载体pgLes-nspTR161ac和pBgGl-hph(含有灵芝gpdl-Gl启动子及潮霉素抗性基因)共转化进入银耳芽孢TrOl感受态细胞,经过MA培养基和PDA培养基(含愈创木酚)筛选得到表达漆酶的转化子Tr01-pgLes-nspTR161ac。   2.3银耳芽孢转化子产漆酶酶活测定   随机挑选5个转化子在YPD液体培养基(含有0.3mmol CuS04和0.8%丙氨酸(m/v)中,25℃摇瓶培养。发酵液中未能检测到漆酶酶活。提取银耳芽孢总蛋白后,检测得到漆酶酶活,漆酶表达量为0.08 U/g鲜重细胞。   2.4重组漆酶特性研究   通过空白TR01与转化子总蛋白的SDS--PAGE电泳分析,推断银耳漆酶表观分子量为59 Kda。该漆酶与ABTS的最适反应温度为40℃,最适反应pH为4.5,在pH7.0时最稳定。Km值为0.48 mmol/L。
其他文献
冬季是一个闭藏的季节,水因寒而冰冻,地因寒而坼裂,万物都潜伏起来,故称为“闭藏”.适应冬天藏气的调养,人们应早睡晚起,等到日光出现再起床,避免严寒,保持温暖,不要使皮肤开
期刊
孩子要和父母住rn案例一rn一位中年女士这样诉说自己的困惑:不知道为什么,我总是感觉不受别人欢迎,感觉别人在排斥自己.我就想努力搞好关系,主动表示热情,甚至总是想方设法讨
期刊
冬月这一天,离过年还有1个月,我在朋友圈做了一个粗略的调查,对于即将到来的年终聚你有什么感想?rn“不想过年.”rn“没什么特别令人期待的聚会.”rn“有压力.”rn“除了催婚
期刊
“我们的一些大学,包括北京大学,正在培养一些‘精致的利己主义者’.他们高智商,世俗,老到,善于表演,懂得配合,更善于利用体制达到自己的目的.这种人一旦掌握权力,比一般的贪
期刊
呵呵,先在《本草纲目》里找找古人说核桃的那些好话吧.“核桃味甘性平微苦微涩,有补肾固精、健脾补血、通便润肠、宁心安神等功效.”rn核桃的好,值得一样一样地说.rn减肥的人
期刊
本文主要是以柚子皮为原料,对其中水溶性膳食纤维(SDF)和水不溶性膳食纤维(IDF)的提取条件进行优化研究,并测定优化条件下两种提取物的颜色、持水性、持油性、溶胀性、单糖组成
整体煤气化燃气——蒸汽联合循环(简称IGCC)是一种先进的高效低污染的清洁煤发电技术,是多种高新技术的合成,由气化、动力、脱硫、空分四个岛组成。IGCC系统整体化要求高,系统
膏方,又称煎膏或膏滋,属于中医传统“丸、散、膏、丹、汤”五大剂型中的一种,具有滋补强身、抗衰延年、治病纠偏等多种作用,在预防疾病和促进人类健康方面功不可没.rn所谓“
期刊
过年了,一家人围坐在热气腾腾的火锅旁,把臂共话,举箸大啖,温情荡漾.但火锅,这个冬日里的“温柔杀手”,却让大家在饱餐之后出现不同的反应:温柔的妈妈和可爱的妹妹,感觉全身
期刊
干气密封是目前出现的一种新型气体密封,比起传统的机械密封具有很多优越性,并且能够承载许多特殊工况下的密封,干气密封摩擦界面的摩擦磨损特性与其设备承载能力、安全性、寿命长短以及泄漏量等密切相关。随着生产水平的不断提高对机械设备的密封性能要求越来越高,干气密封端面的研究也越来越深入,其应用已经由以往的常温、常压工况下逐渐拓展到高温、高压、低温、真空等特殊工况甚至为一些极端工况。为了能够使得一些重要以及