目的:肝细胞肝癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)是人类最常见的恶性肿瘤之一,其在肿瘤相关疾病中的发病率和死亡率一直居高不下。在我国,肝癌在所有肿瘤中发病率居第四位,而死亡率在肿瘤相关性死亡中居第二位。随着医疗技术的不断进步,尽管出现了日益先进的诊断技术,渐渐规范精湛的外科手术,还有逐步改善的辅助性化疗,甚至肝移植技术的普及,可是肝癌患者的预后依然不容乐观。这都是由于肝癌的隐匿性发展和不可预知的转移,多数患者在就诊时就已经失去了手术的最佳时机,而术后复发和肿瘤耐药问题,更是导致肝癌患者死亡的决定性因素。谈“肝癌”色变,仍然是当前患者和医生的深刻感触。医学的飞速发展,离不开医学科研的不断进步,迄今为止,世界各地的学者已经发现了多种和肝癌生长、增殖、转移、耐药等相关的分子及通路机制,而科研中取得的成果,诸如分子靶向治疗,干细胞治疗等等也在慢慢的向临床转化。治愈肝癌任重而道远,其困难源于肝癌背后的机制过于复杂,另外,90%以上肿瘤患者的死亡归因于转移的发生,因此,研究肿瘤转移的机制和预防具有非常重要的意义。自从泛素—蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)被发现后,多方证实其参与了细胞的基因转录、周期调控、凋亡与分化、信号转导和细胞发育等多个生物学过程,是一种重要的蛋白质翻译后修饰体系。其中泛素连接酶E3中最核心的F-box蛋白—Fbxw7(F-box and WD repeat domain-containing protein 7),可识别多个原癌蛋白并参与其泛素化和降解,发挥着抑制肿瘤的生物学功能,近年研究发现在多种肿瘤中Fbxw7发生了基因突变或表达降低。Fbxw7蛋白是当前研究的热点之一,比较集中的研究方向有干细胞和肿瘤干细胞的转归,肿瘤增殖和侵袭,耐药等等。但在肝癌方面的研究为数不多,集中涉及其在肝癌组织的表达情况及对肝癌细胞增殖的影响,目前国内外还未见有Fbxw7在肝癌侵袭和转移中的机制的报导,因此,本课题设计并施行了以下研究,为探求Fbxw7在肝癌转移中是否起到了作用及其作用机制有哪些。方法:我们首先收集并随访了102例肝癌患者的组织标本,石蜡包埋并切片,利用免疫组化染色来观察Fbxw7在肝癌和癌旁组织中的表达情况,并与患者的临床病理资料结合来分析Fbxw7对于肝癌的意义,随后用Real-time PCR和Western-blot的方法检测了肝癌细胞系中Fbxw7的m RNA和蛋白水平的表达。接下来我们构建了能够稳定下调/上调Fbxw7的病毒载体并转染至肝癌细胞系,使肝癌细胞系可以稳定下调/上调Fbxw7的表达,继而使用Real-time PCR,Western-blot,ELISA,Transwell实验,构建裸鼠肺转移模型等实验方法检测转染病毒后的肝癌细胞转移相关指标的改变,并探索其中涉及到的机制。结果:1.免疫组化染色结果得知在肝癌组织中Fbxw7的表达比癌旁组织中要低。与临床病理特征结合的分析结果显示,高Fbxw7水平和低Fbxw7水平组患者之间,肿瘤分化(P=0.013),脉管浸润(P=0.031),转移(P=0.027)和AJCC肿瘤分期(P=0.047)都是有明显的统计学差异的。Kaplan-Meier法生存分析提示,高Fbxw7表达组患者有着更长的生存时间(log-rank,P<0.001)。单因素和多因素Cox回归分析均表明,低Fbxw7表达能够作为肝癌患者预后较差的独立指标。2.以肝细胞系HL-7702为对照,使用Real-time PCR和Western-blot检测了肝癌细胞系Hep G2,SMMC7721和MHCC97H中Fbxw7的表达情况,结果提示,肝癌细胞系中Fbxw7的表达明显低于肝细胞系(P<0.05),且在Hep G2,SMMC7721和MHCC97H中Fbxw7的表达水平是依次降低的。3.构建上调Fbxw7的GV341-puro慢病毒载体和下调Fbxw7的GV118-GFP慢病毒载体,根据细胞系中Fbxw7的相对高低水平选择了在Hep G2中下调Fbxw7,在MHCC97H中上调Fbxw7,转染完毕后通过Real-time PCR和Western-blot检测过表达和干扰效果,成功构建了KD-Fbxw7-G2和OE-Fbxw7-97H,他们各自的对照为NC-Fbxw7-G2和NC-Fbxw7-97H。4.在确定了病毒本身对细胞活力无影响的前提下,通过Transwell实验及裸鼠肺转移模型的构建实验发现,下调了Fbxw7表达的KD-Fbxw7-G2细胞的侵袭和迁移能力较对照细胞有明显的增强,而上调了Fbxw7表达的OE-Fbxw7-97H细胞的侵袭和迁移能力比对照细胞有明显的减弱。5.通过Western-blot,Real-time PCR及ELISA检测了KD-Fbxw7-G2和OE-Fbxw7-97H细胞中活化的Notch1的变化情况,并检测了ERK1/2通路的活化情况及MMP-2,MMP-9和u PA的表达变化,结果发现,抑制Fbxw7的表达可以上调Notch1的NICD的表达,并激活ERK1/2,继而使MMP-2,MMP-9和u PA表达增加,而使用Notch1的小干扰RNA对细胞进行干扰后,本已增强的细胞迁移和侵袭的能力发生了回落。结论:我们的研究结果表明,Fbxw7可以用于肝癌患者的预后标志物;Fbxw7在肝癌的进展中发挥了重要的作用,并首次发现了Fbxw7可能通过Fbxw7/Notch1/ERK1/2轴来调控肝癌细胞的侵袭和转移能力。