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目的:
建立胶原诱导性关节炎(collagen—induced arthritis,CIA)大鼠模型,通过检测给药前后血清和膝关节液核因子κB受体活化因子配体(recepter activator ofnuclear factor-κB ligand,RANKL)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)浓度,以及RANKL、OPG在膝关节滑膜组织的表达,研究RANKL／OPG系统在CIA大鼠关节病变发生发展中的作用。以空白组和模型组作对照,研究甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)和99锝[99Tc]-亚甲基二膦酸盐(Technetium-99 tertiarydiphosphine,99Tc-MDP,商品名:云克)对CIA大鼠血清、膝关节液RANKL、OPG浓度和膝关节滑膜RANKL和OPG表达的影响,探讨MTX和99Tc-MDP的干预作用。
方法:
48只雄性Wistar大鼠随机选取8只作为空白组,其余40只用于造模。造模大鼠自尾根部至背部皮下多点注射鸡Ⅱ型胶原乳剂(0.5ml／只),一周后等量加强免疫；空白组皮下注射等量生理盐水作对照。初次免疫后第28天进行关节炎指数(arthritis index,AI)评分,选取24只AI评分≥6分大鼠随机分为模型组、MTX组和99Tc-MDP组,每组8只。MTX组:尾静脉注射MTX(2.4mg／(kg·w)),持续3周,给药间歇内每天尾静脉注射等体积生理盐水；99Tc-MDP组:尾静脉注射99Tc-MDP(含99锝0.04μg／(kg·d)),持续3周;空白组及模型组每日尾静脉注射同99Tc-MDP组等体积生理盐水作对照,持续3周。给药前及给药后每周进行一次AI评分及尾静脉取血,给药结束后留取左后肢膝关节液,采用酶联免疫吸附(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)法测定大鼠血清及膝关节液RANKL、OPG浓度；留取右后肢膝关节,脱钙后行苏木素-伊红(HE)染色,观察膝关节滑膜、软骨和骨病理变化并计算病理评分,行免疫组织化学染色检测膝关节滑膜RANKL和
OPG表达；留取左后肢膝关节滑膜,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测滑膜RANKL、OPG表达。所有实验数据均以(x)±s形式表示,用SPSS18.0软件进行正态性检验,组间比较采用采用t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
结果:
1)40只大鼠用于造模,造模成功24只,成功率60％。
2)给药后,MTX组和99Tc-MDP组关节炎指数明显低于模型组(P<0.01),99Tc-MDP组明显低于MTX组(P<0.01)。模型组和MTX组给药后3周明显高于给药前(P<0.01)；99Tc-MDP组给药后1周明显低于给药前(P<0.01)。
3)给药后MTX组和99Tc-MDP组大鼠血清RANKL、OPG浓度及比值明显低于模型组(P<0.01),99Tc-MDP组明显低于MTX组(P<0.01)。空白组给药前后未见明显变化(P>0.05)；模型组和MTX组给药后3周明显高于给药前(P<0.01)；99Tc-MDP组给药后1周明显低于给药前(P<0.01)。
4)给药结束后,模型组、MTX组和99Tc-MDP组膝关节液RANKL、OPG浓度及RANKL／OPG比值明显高于空白组(P<0.01)；MTX组和99Tc-MDP组明显低于模型组(P<0.01)；99Tc-MDP组明显低于MTX组(P<0.01)。
5)99Tc-MDP组和MTX组膝关节病理评分明显低于模型组(P<0.01)；99Tc-MDP组明显低于MTX组(P<0.01)。
6)模型组、MTX组和99Tc-MDP组膝关节滑膜RANKL、OPG表达以及二者半定量比值明显高于空白组(P<0.01),MTX组和99Tc-MDP组明显低于模型组(P<0.01),99Tc-MDP组明显低于MTX组(P<0.01)。
结论:
1.应用完全弗氏佐剂乳化的鸡Ⅱ型胶原乳剂可成功诱导CIA大鼠模型。
2.CIA大鼠血清和膝关节液RANKL、OPG浓度明显升高,膝关节滑膜RANKL、OPG表达明显增强,提示RANKL和OPG可能参与了CIA大鼠病变的发生发展,RANKL／OPG比值升高可能是CIA大鼠关节发生破坏的机制之一。
3.MTX和99Tc-MDP均可降低血清及膝关节液RANKL和OPG浓度、抑制膝关节滑膜RANKL和OPG表达,提示二者可能通过降低RANKL／OPG比值达到改善关节滑膜炎症、软骨和骨质破坏的作用。
4.99Tc—MDP组大鼠血清和膝关节液RANKL、OPG浓度及膝关节滑膜RANKL、OPG表达半定量结果明显低于MTX组,结合关节炎指数和膝关节病理评分,认为本实验周期内99Tc-MDP组疗效优于MTX组。
5.99Tc-MDP组关节炎指数和血清RANKL、OPG浓度于给药后1周开始低于给药前,MTX组给药后3周仍高于给药前,提示本实验周期内99Tc-MDP组起效时间早于MTX组。