结核病(TB)是分别由结核分枝杆菌(Mtb)和牛分枝杆菌(牛分枝杆菌)引起的人类和牛的高传染性疾病。两种物种都拥有近99％的基因组同一性，并且可以以比感染自己的宿主更少的疾病严重程度感染彼此的宿主。这一观察结果导致了针对人类结核病的卡介苗芽孢杆菌(BCG)疫苗(牛分枝杆菌的改良形式)的开发。目前，卡介苗是唯一可用于结核病的疫苗，对成人没有增强作用和功效。有希望的辅助剂或BCG补充剂仍然是克服结核病威胁的主要挑战。考虑到这一事实，使用免疫信息学方法从Mtb中三个分泌系统的蛋白质：双精氨酸易位(TAT)，Esx和Sec设计了亚单位疫苗。分泌蛋白的免疫原性表位被预测并用于疫苗方案。然后，通过使用各种在线工具对疫苗进行计算机评估。这些工具宣告了该疫苗是稳定的，非过敏性的，具有抗原性(免疫原性)，并且对通行费样受体2(TLR2)具有结合亲和力。对于疫苗蛋白的细胞内表达，将氨基酸序列反向翻译为核苷酸序列，并将其克隆到腺相关病毒载体(pAAV)中。将没有和带有疫苗蛋白的病毒载体包装到AAV-Dj/8双顺反子表达系统中。分别通过qPCR和qRT-PCR对两种病毒进行了体外表征，以估计其DNA和RNA的拷贝数。两种病毒的拷贝数都在可接受的范围内，即109/mL-1011/mL。两种病毒均已准备就绪，可用于临床前研究。
　　为了进一步表征亚单位疫苗，预测了其表位参与亚单位疫苗设计的18种蛋白质的功能分析与宿主DNA的结合。6个显示阳性预测，其中2个：EsxT(Rv3444c)和EsxU(Rv3445c)被选择进行分析。两者均属于Esx-4簇(功能未知)，并且存在于整个分枝杆菌科家族中。两种蛋白质都单独或一起在核中定位，通过免疫荧光测定法检测。同样，通过免疫共沉淀鉴定了两者之间的物理相互作用。为了确定两种蛋白质与宿主基因组之间的相互作用，生成了慢病毒诱导的THP1稳定细胞系，THP1-OE(同时表达两个基因)和THP1-GFP(对照)，并将其用于组蛋白修饰，RNA测序，细胞因子分析和细菌活力分析。在组蛋白H3的赖氨酸27位置进行了三甲基化和乙酰化。三甲基化未显示明显特征，而乙酰化在两种细胞系中均提供了多个富集区域和转录因子(TF)。只有THP1-OE细胞系富集区域参与了针对Mtb感染进展的宿主免疫调节。RNA-seq数据提供了差异表达的基因，其中大多数上调基因都属于核酸结合类别。RNA-seq数据还证明，与THP1-GFP相比，THP1-OE细胞系的免疫学特征受到抑制。THP1-OE细胞系中的细胞因子分析数据(促炎性细胞因子折叠表达减少)和Mtb活力测定(活力增强)支持了这一点。通过CRISPRi技术产生组合敲除(KD)菌株，进一步进行了Mtb中两种蛋白质的功能研究。通过用WT/KD菌株感染THP1细胞再次进行RNA-seq。这表明高度下调的基因属于核酸结合类别。在这里，与WT感染的相比，KD感染的THP1细胞的免疫学特征得到了改善。在KD感染的THP1细胞中，通过细胞因子分析数据(促炎性细胞因子折叠表达提高)和Mtb活力测定(活力降低)证实了这一点。体内(小鼠模型)研究还证明，与WT感染的小鼠相比，KD感染的小鼠的促炎细胞因子水平升高(肺)，Mtb活力降低(肺和脾)。然而，肺脏和脾脏样品的组织病理学显微照片没有显示出比野生型感染小鼠明显的病理学影响。总体而言，本研究使用免疫信息学方法全面描述了Mtb亚单位疫苗的设计，并在功能上分析了两种疫苗参与蛋白。两种蛋白的结合在调节宿主免疫状态和Mtb存活方面与宿主基因组有很强的相互作用。