近30年来,随着医学科学技术的进步,造血干细胞及器官移植、免疫抑制剂的大量应用、癌症病人的放疗及化疗、广谱抗生素的大量使用、各种内置生物材料的应用及艾滋病的蔓延,侵袭性真菌感染的发病率及死亡率在全球呈显著上升趋势,真菌感染日益引起人们关注。各种侵袭性真菌感染中以白念珠菌的感染发生率最高,一方面临床上有效的抗白念珠菌的药物非常有限,另一方面由于白念珠菌自身的特性容易在一些生物材料表面形成生物被膜(biofilm),给临床治疗带来一大挑战。而生物被膜对大多数现有的抗真菌药物都表现出高度耐药的特点,内置生物材料表面一旦形成生物被膜,就会容易引起反复感染并最终导致治疗的失败。因此,寻找新型的抗白念珠菌药物以及有效的抗生物被膜的药物显得意义重大。我们课题组在前期研究中发现紫檀茋(pterostilbene,PTE)具有很好的抗生物被膜活性,同时PTE是白藜芦醇的结构类似物,而白藜芦醇是广泛应用的很好的保健品,这也就决定了它们具有低毒的优势,有希望成为一个先导化合物,来进一步研发成抗生物被膜的药物。因此在本课题中,为了发现高效低毒的抗生物被膜药物以及为后期PTE的结构改造奠定基础,我们在本研究中开展了PTE抗白念珠菌生物被膜的构效关系的研究。我们在前期发现PTE的抗生物被膜活性的同时,也进行了其作用机制的探讨,芯片实验中发现PTE处理后大量自噬相关基因的表达发生改变。细胞自噬现象最初是在20世纪60年代初发现的,是指细胞内受损变性或衰老的蛋白质和细胞器被运输到溶酶体或液泡中,利用其中的酶进而对这些废弃物进行消化降解然后进行物质的重新利用的一个过程。自噬是当前的一大研究热点,在酵母和哺乳动物细胞关于自噬的研究十分成熟,而且明确了自噬在细胞应对外界应激以及对环境的适应性过程中发挥着重要的作用。但是自噬在白念珠菌中的研究才刚刚起步,而且存在争议。Glen E.Palmer课题组认为自噬对白念珠菌的生理学过程没有意义,但是近两年南开大学李明春教授课题组认为白念珠菌的自噬在其应对各种外界刺激如氧化应激、渗透压应激等过程中发挥作用,同时与白念珠菌的致病力相关。关于白念珠菌自噬的文献报道本来就少,而且两课题组的观点还是相悖的,那么自噬到底在白念珠菌中发挥怎样的作用,尤其是我们用抗生物被膜的小分子化合物PTE处理后自噬相关基因表达发生改变,那么自噬在白念珠菌生物被膜中是否发挥作用,关于这部分目前还没有文献报道,值得我们进行深入研究。在抗真菌的研究领域,大多数课题组都致力于发现新的具有抗真菌活性的小分子化合物。我们在研发药物时,发现具有明确作用靶点的小分子化合物才是有意义的,因此揭示小分子化合物的作用靶点非常重要,那么建立和优化寻找小分子化合物药靶的方法就有着举足轻重的意义。在哺乳动物细胞中寻找药靶的方法很多,如同位素示踪法、荧光光谱法、基于基因组学、蛋白组学的研究方法等等,其中darts(drugaffinityresponsivetargetstability)因其原理较为简单、操作步骤少,而且不需要对小分子化合物的结构进行改造,得到的结果更加可靠而得到科学家们的重视和广泛应用,已有报道用这个实验方法成功应用于哺乳动物细胞,找到抗衰老药物雷帕霉素和白藜芦醇的作用靶点。本课题就尝试用darts这个方法来进行抗真菌药物作用靶点的研究。实验结果如下:第一部分:我们进行了pte抗白念珠菌生物被膜的构效关系研究。为了方便研究,我们将pte的结构分成了3个部分,通过xtt法考察了rpmi1640培养基中pte及28个结构类似物的抗白念珠菌生物被膜能力(包括对生物被膜形成能力以及成熟生物被膜的影响),其中重点考察了与pte结构较接近的15个结构类似物。我们发现a部分的羟基(-oh)一旦被其它取代基(包括c1-c5,b1和b2)替代,这类化合物的抗白念珠菌生物被膜的活性就消失。可以推断对羟基(-oh)对pte类似物的活性是重要的。b部分的双键变为单键(c6)时,活性变弱,表明双键有助于此类化合物的最佳活性的发挥。当双键成为呋喃环(b3)的一部分时,该化合物对生物膜具有与pte几乎相同的抑制活性。然而,当双键变成不饱和内酯(c7)的一部分时,或者a部分和b部分形成环状酯(b4)时,几乎丧失了活性。c部分的间位双甲氧基,我们通过改变甲氧基(-och3)的数目或将甲氧基(-och3)置换成羟基(-oh),化合物活性均变弱,表明间位双甲氧基(-och3)有助于维持这类化合物的最佳抗白念珠菌生物被膜活性。同时菌丝形成是生物被膜形成过程中的重要环节,我们用spider和rpmi1640液体培养基中的菌丝实验结果进一步验证了生物被膜的结果。针对spider和rpmi1640培养基成分的主要差异,我们还考察了spider+2g/lglucose培养基中pte结构类似物对菌丝形成的影响,发现pte、c4、c6、b3、b5和b6在这3种培养基均呈现一致的浓度依赖的菌丝抑制作用。上述结果表明对位羟基(-oh)优于其他取代基,双键和间位双甲氧基(-och3)有助于维持pte抗白念珠菌生物被膜的最佳活性。第二部分:我们考查了自噬对白念珠菌生物被膜的影响。本研究中我们通过以酿酒酵母为阳性对照,利用雷帕霉素(自噬诱导剂)、巴弗洛霉素a1(自噬抑制剂)等工具药和atg8Δ/Δ、ccz1Δ/Δ(casat1筛选标记敲除目的基因策略)等工具菌,通过检测一系列指标,如相差显微镜下自噬小体的计数,吖啶橙(ao)染色检测染色阳性率以及碱性磷酸酶活性检测,确证了白念珠菌和酿酒酵母一样,确实存在自噬这一生理过程,而且哺乳动物细胞中的自噬工具药也适用于白念珠菌。接下来我们又用这些指标考察了白念珠菌生物被膜中的自噬,发现白念珠菌生物被膜中自噬水平大大提高。real-timertpcr考察白念珠菌生物被膜中自噬相关基因的表达情况,显示自噬相关基因ccz1、atg1-10、atg12、atg13、atg16-18和chk1的表达均发生上调,表明生物被膜状态的细胞自噬水平确实提高。通过xtt法考察了自噬基因敲除菌及亲本菌生物被膜的形成能力,发现亲本菌和敲除菌形成的生物被膜在24h无明显差异,但是在生物被膜后期48h、72h以及96h时两者形成的生物被膜存在明显差异。利用生长曲线实验、菌丝形成实验和细胞表面疏水性实验考察菌株的生长情况、菌丝形成能力和粘附能力,发现敲除菌和亲本菌间三者均无明显差异,表明两者形成生物被膜能力的差异与生长、菌丝形成以及粘附无关,与能否发生自噬相关。利用硅胶片实验进一步直观的考察敲除菌和亲本菌的生物被膜差异,显示24h时亲本菌和敲除菌均能形成完整的生物被膜,但是敲除菌形成的生物被膜到48h后更容易脱落。激光共聚焦实验考察敲除菌和亲本菌的生物被膜内部结构的差异,显示亲本菌和敲除菌形成的生物被膜内部结构存在明显差异。为了更进一步的确证结果,我们还考察了自噬抑制剂bfm在以上实验中的结果,bfm的实验结果与敲除菌一致,表明自噬确实影响白念珠菌生物被膜的维持以及内部结构。菌液涂板实验考察一些临床常用抗真菌药物对敲除菌和亲本菌形成的成熟生物被膜的抑制能力,发现敲除菌形成的生物被膜对常用抗真菌药物更加敏感,表明生物被膜态细胞的耐药性与自噬发生与否密切相关。最后我们利用线虫感染模型考察了敲除菌的致病力,发现敲除菌致病力大大下降。第三部分:我们明确了pte对白念珠菌生物被膜的强大抑制作用,并完成了初步的构效关系研究,我们想进一步探讨pte发挥作用的靶点。研究中,我们先通过优化各个环节的实验条件(包括蛋白提取,蛋白酶的种类、作用浓度和时间,跑胶条件等等),成功构建了darts体系,用这个体系重复文献中的实验结果。即找到雷帕霉素和白藜芦醇的差异蛋白条带,差异条带进行质谱分析也得到了文献报道的两者的作用靶点fkb12和eif4a,同时我们也用构建的体系去成功确证了抗白念珠菌阳性药氟康唑(fluconazole,flu)的药靶。接下来我们就用改善实验条件的体系去寻找pte作用的靶点,并尝试进一步提取膜蛋白以及改变分离胶的浓度去进行实验,期望在后续的研究中明确pte的作用蛋白,也为今后发现其他抗白念珠菌小分子药物的作用靶点提供了新的思路和方法。总而言之,构效关系(sar)研究表明pte结构类似物抗生物被膜活性与其结构密切相关,其中a部分的对位羟基(-oh)化合物表现出比其它取代基取代的化合物更好的活性,b部分的双键以及c部分的间位双甲氧基(-och3)都利于此类化合物发挥最好的抗白念珠菌生物被膜的活性;作为一种机会致病菌,白念珠菌中确实存在自噬这一生理过程,同时自噬在白念珠菌生物被膜中发挥着举足轻重的作用,即自噬在维持白念珠菌成熟生物被膜的稳定性及内部结构中发挥重要作用,同时与生物被膜的高度耐药的现象密切相关;DARTS实验体系可以用于抗白念珠菌药物的作用靶标的找寻和确证,用该方法已成功确证了抗白念珠菌阳性药FLU的作用靶点,但是由于白念珠菌细胞自身以及小分子化合物的一些特异性,具体实验过程中可能需要去进一步优化实验条件,有望揭示更多小分子药物的作用靶点。