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第一部分,临床甲状腺癌标本中Kat5表达与患者预后之间的相关性研究实验目的:甲状腺乳头状癌是最为常见的甲状腺恶性肿瘤,虽然绝大多数患者预后较好,但有一定比例患者的肿瘤恶性程度较高,目前缺乏有效治疗手段,因而预后较差。此外,尽管未分化甲状腺癌发病率较低,但预后极差,患者中位生存期仅为5个月,造成了绝大多数的甲状腺癌相关性死亡。目前对于部分甲状腺乳头状癌以及未分化甲状腺癌高度恶性的潜在机制尚不明确。DNA损伤应答能促进肿瘤的进展及放化疗抵抗,成为临床抗肿瘤治疗的重要靶点。本部分实验主要探讨临床甲状腺乳头状癌及未分化甲状腺癌标本中DNA损伤应答关键蛋白Kat5的表达水平与患者预后之间是否存在相关性。材料和方法:通过免疫组化染色测定临床甲状腺乳头状癌及未分化甲状腺癌标本中Kat5蛋白的表达水平,通过卡方检验研究Kat5表达与患者肿瘤包膜受侵、淋巴结转移、远处转移等不良预后因素之间的相关性,并通过生存分析研究Kat5表达与未分化甲状腺癌患者生存期之间的相关性。结果:1、通过免疫组化染色定量317例甲状腺乳头状癌标本中的Kat5蛋白表达水平,并通过卡方检验发现Kat5表达与患者肿瘤包膜受侵(P值小于0.001)及淋巴结转移(P值小于0.001)均显著相关。2、通过免疫组化染色定量60例未分化甲状腺癌标本中的Kat5蛋白表达水平,通过卡方检验发现Kat5表达与患者淋巴结、远处转移显著相关(P值小于0.001),并通过生存分析发现Kat5表达与患者较差预后显著相关(P值小于0.001)。结论:肿瘤组织中Kat5表达与包膜受侵、淋巴结转移、远处转移及较差预后显著相关,需要进一步深入研究Kat5在甲状腺癌进展及治疗抵抗中所起的具体作用及潜在分子机制。第二部分Kat5在甲状腺癌进展及放化疗抵抗中所起作用的研究实验目的:基于第一部分的研究结果,我们假设甲状腺癌组织中异常高表达的Kat5可能促进了肿瘤的进展及治疗抵抗,因而造成了患者较差的预后。本部分实验主要探讨Kat5对人甲状腺乳头状癌以及未分化甲状腺癌细胞增殖、迁移、侵袭、远处转移、血管生成等肿瘤表型的影响。材料和方法:通过转染质粒过表达人甲状腺癌细胞中Kat5,并通过转染si RNA敲低细胞中Kat5表达,随后通过MTT实验、克隆形成实验、结晶紫染色实验、划痕实验、Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验、体外脉管生成实验等手段研究Kat5对人甲状腺癌细胞增殖、迁移、侵袭、血管形成能力及放化疗敏感性的影响。随后分别建立稳定过表达Kat5和稳定敲低Kat5表达的的人甲状腺癌细胞,并进一步通过裸鼠异种移植瘤模型研究Kat5对人甲状腺癌细胞远处转移能力的影响。结果:我们通过结晶紫染色实验、MTT实验以及克隆形成实验发现过表达Kat5能显著促进人甲状腺乳头状癌细胞Tpc1和人未分化甲状腺癌细胞8505c的增殖,同时敲低Kat5显著抑制8505c细胞的增殖。Transwell侵袭实验结果表明Kat5质粒显著增加了Tpc1及8505c细胞的侵袭能力,而Kat5 si RNA则显著降低了8505c细胞的侵袭能力。体外脉管生成实验结果表明Kat5质粒增加了8505c细胞的脉管形成能力,相反Kat5 si RNA则显著抑制了8505c细胞的脉管形成能力,而恶性程度较低的Tpc1细胞没能在基质胶上形成脉管。MTT及克隆形成实验结果表明过表达Kat5增加了Tpc1细胞、8505c细胞对化疗及放疗的抵抗,同时敲低Kat5则显著增加了8505c细胞的放化疗敏感性。动物实验结果表明过表达Kat5显著增加了Tpc-1细胞的远处转移能力,而敲低Kat5则显著削弱了了8505c细胞的远处转移能力。结论:Kat5可以促进人甲状腺乳头状癌以及未分化甲状腺癌细胞的增殖、侵袭、远处转移、血管形成以及放化疗抵抗,因而成为临床甲状腺癌治疗的潜在新靶点。第三部分Kat5促进甲状腺癌进展及放化疗抵抗的潜在机制实验目的:基于上一部分的研究数据及文献检索结果,我们进一步假设在人甲状腺乳头状癌及未分化甲状腺癌中,Kat5可能通过经典肿瘤蛋白c-myc促进了肿瘤的进展及治疗抵抗。材料和方法:通过转染质粒过表达人甲状腺癌细胞中Kat5,并通过转染si RNA敲低细胞中Kat5表达,随后通过Western Blotting、q RT-PCR以及免疫共沉淀等实验研究Kat5对人甲状腺癌细胞中c-myc表达的影响。结果:Western blotting结果表明过表达Kat5提高了Tpc1及8505c细胞中c-myc蛋白的水平,并延长了c-myc蛋白的半衰期,而敲低Kat5表达则降低8505c细胞中c-myc蛋白的表达,同时缩短了c-myc蛋白的半衰期。此外,免疫共沉淀结果表明Kat5提高了Tpc1及8505c细胞中被乙酰化的c-myc蛋白,并减少了细胞中被泛素化标记的c-myc蛋白,相反敲低Kat5表达则减少了8505c细胞中被乙酰化c-myc蛋白,同时增加了细胞中被泛素化标记的c-myc蛋白。结论:Kat5通过乙酰化作用延长c-myc蛋白的半衰期,同时抑制了c-myc蛋白的泛素化降解,从而提高了人甲状腺癌细胞中c-myc蛋白的水平。因而Kat5可能通过c-myc通路促进了甲状腺癌的进展及治疗抵抗。