论文部分内容阅读
不育症与心血管疾病、肿瘤并列为影响人类生活和健康的三大主要疾病,其中男性不育症因其不断上升的发病率引起越来越多国内外学者的关注。男性不育症通常由多种病因共同引起,治疗手段有限,目前主要依靠药物治疗,临床效果不佳且毒性较大,因此寻求低毒高效的治疗药物成为了目前研究的热点,海洋作为天然药物的宝库,拥有丰富的可开发利用的资源。C-藻蓝蛋白(C-phycocyanin,C-PC)是从螺旋藻中提取的一种具有多种药理作用的蛋白复合物,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、免疫抑制等活性。大量研究表明,C-PC可以提高猪卵母细胞的受精能力,可以提高胚胎的发育潜力。在生殖系统的发育过程中,生殖细胞除常见的凋亡和坏死外,还存在一种程序性坏死,即坏死性凋亡,其调节机制为激活受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)、受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)、混合谱系激酶域样蛋白(MLKL),坏死性凋亡对生殖系统的发育和进化具有负面作用,通过对RIPK1-RIPK3-MLKL信号通路介导作用的研究,一些坏死性凋亡抑制剂可以有效地维持生殖细胞的活力,从而起到保护男性生殖系统的作用。本课题旨在探究C-PC是否可以作为一种坏死性凋亡的抑制剂,从而对男性生殖系统起到保护作用,为C-PC的开发和利用提供了新的方向和理论依据,具有重要的研究价值。目的:探究C-PC通过调节RIPK1-RIPK3-MLKL信号通路对雄性小鼠生殖系统发挥保护作用的具体机制。方法:1、GC-1 spg小鼠精原细胞坏死性凋亡模型的构建:通过坏死性凋亡诱导试剂(TSZ)处理GC-1 spg细胞构造生殖损伤细胞模型,将实验分为四组:Control、TSZ、TSZ+C-PC、TSZ+Nec-1,Necrostain-1(Nec-1)是一种RIPK1的抑制剂,可以抑制RIPK1的磷酸化。通过CCK-8实验和流式细胞术检测C-PC对于TSZ诱导的GC-1spg细胞的增殖活力和坏死率的影响,通过免疫荧光、q RT-PCR、Western blot等方法检测C-PC对TSZ诱导后坏死性凋亡相关基因和蛋白(TNF-α、RIPK1、RIPK3、MLKL、p-MLKL)的表达,探索C-PC对于RIPK1-RIPK3-MLKL信号通路的调控作用。2、ICR雄性小鼠生殖损伤模型的构建:通过大剂量腹腔注射环磷酰胺(Cy),构造生殖损伤小鼠模型,实验分为四组:Control、Cy Model、Cy+C-PC(low concentration)、Cy+C-PC(high concentration)。通过计算小鼠的生殖器官系数,对小鼠的精子进行数目统计、畸形率和死亡率的计算,评估C-PC对于小鼠生殖器官和精子质量的影响。3、通过对睾丸组织中的超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量进行检测,探究C-PC对于睾丸组织氧化损伤的保护作用。通过ELISA检测小鼠血清中睾酮(T)、促卵泡素(FSH)和促黄体生成素(LH)等性激素的释放水平,研究C-PC对于小鼠生精能力的影响。4、通过HE染色睾丸组织,对睾丸组织进行病理学观察,对小鼠的生精动力学进行分析,探索C-PC对于睾丸生精能力的保护作用。5、通过免疫组化和Western blot检测C-PC对于Cy诱导的雄性小鼠睾丸组织中RIPK1、RIPK3、MLKL、p-MLKL等蛋白的表达,探索C-PC对于睾丸组织发挥保护作用的具体机制。结果:1、低浓度的C-PC可以促进GC-1 spg细胞的增殖,高浓度的C-PC可以抑制GC-1 spg细胞的增殖。TSZ可以抑制GC-1 spg细胞的增殖,并且呈现时间和剂量的依赖性。随着TSZ作用时间的延长,GC-1 spg细胞的坏死率逐渐增加,RIPK1、RIPK3、p-MLKL、TNF-α等蛋白的表达也随着TSZ浓度的增加而升高。与TSZ处理组相比较,TSZ+C-PC和TSZ+Nec-1处理组GC-1 spg细胞活力明显升高,坏死率也明显下降。此外,TSZ+C-PC和TSZ+Nec-1处理组RIPK1、RIPK3、p-MLKL、TNF-α等蛋白的表达水平也降低。2、与对照组小鼠相比较,Cy模型组中的小鼠的生殖器官系数和精子质量下降,精子数目减少,精子畸形率和死亡率增加,同时小鼠的生殖力下降,而与Cy模型组相比,C-PC处理组小鼠的生殖器官系数和精子质量得到了改善,精子数目增多,畸形率和死亡率下降,生殖力提高,并且高浓度的C-PC作用效果更显著。3、与对照组小鼠相比,Cy处理组中小鼠睾丸组织中SOD活性减少,MDA含量增加,出现了脂质过氧化物的积累,而C-PC处理组中SOD活性增加,MDA含量减少,同样,高剂量的C-PC作用效果更显著。与对照组相比,Cy处理组小鼠血清中的T、FSH和LH的释放水平减少,而与Cy模型组相比,C-PC处理组中这三种激素的释放水平增多。4、通过对小鼠的生精动力学进行分析,与对照组小鼠相比较,Cy模型组小鼠睾丸组织中各种生精细胞数目减少,睾丸间质细胞和细胞核的体积减少,生精小管上皮细胞变薄,生精细胞数量减少,管腔内形成空腔,而与Cy模型组相比,C-PC处理组中小鼠睾丸组织中各种生精细胞数目增多,睾丸间质细胞和细胞核的体积增加,生精小管损伤程度有所改善,生精细胞增多,排列整齐有序,高浓度的C-PC比低浓度的作用效果更显著。5、与对照组相比,Cy模型组中RIPK1、RIPK3、p-MLKL以及MLKL的表达水平均升高,而经过C-PC的处理之后,这些蛋白的表达均降低。结论:C-PC可以减轻TSZ对GC-1 spg细胞的损伤,提高细胞活力,降低细胞坏死率,抑制坏死性凋亡信号通路,从而对GC-1 spg细胞起到一定的保护作用。此外,C-PC还能改善Cy引起的精子密度下降,降低精子畸形率和死亡率,提高小鼠的生殖力,缓解Cy对于小鼠睾丸组织的损伤,保护小鼠生殖系统。其保护机制可能是C-PC抑制了Cy诱导的细胞氧化应激和坏死性凋亡信号通路。