梨pgip基因cDNA的克隆与表达

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植物富含多糖的细胞壁是抵抗病原真菌侵染的屏障。植物致病性真菌在侵染植物的过程中必须首先分泌包括多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PGs)(EC3.2.1.15)在内的酶来降解植物细胞壁才能成功地侵染植物。而在植物的防卫反应中,植物的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibiting protein,PGIPs)能够抑制真菌的内切多聚半乳糖醛酸酶活性。目前,pgip基因已成为植物抗真菌基因工程的研究热点之一,国内外已先后从苹果、树莓等多种植物中克隆到了pgip基因或片断。根据GenBank中梨属pgip基因序列保守区设计1对特异引物,以梨优良矮化砧木S2(Pyrus ussuriensis)叶片总RNA为模板,克隆到1条约1,100bp的cDNA片段,将其与pMD18-T vector连接后转化Escherichia coli JM109,对筛选到的阳性克隆进行序列测定并使用生物信息学方法对所得结果进行综合分析表明:克隆片段为梨pgip基因,命名为Pupgip,GenBank登录号为EU107274,该片段编码330个氨基酸,预测分子量为36,388Da,第1~24个氨基酸残基是信号肽。与梨属其它已获得pgip基因核苷酸序列开放阅读框(Open reading frame,ORF)的同源性为97.5~99.6%,氨基酸序列的同源性为97.6~99.1%。半定量RT-PCR分析显示,该基因在植株各部位表达存在较大差异,茎、叶中的基因表达量明显高于花蕾和花朵。为了进一研究该基因的功能和诱导表达,将该基因的成熟肽编码区克隆到pET-32a(+)表达载体中,成功地构建了该基因的原核表达质粒pET-PuPGIP,并在E.coli BL21(DE3)pLysS中通过IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析证实获得了该基因的重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式出现。
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