论文部分内容阅读
菌蜕（Bacterial ghosts）是通过克隆的phiX174噬菌体溶菌基因E的可调控表达而形成的、缺少细胞浆和核酸的、无繁殖能力的革兰氏阴性细菌菌体。E基因表达后,其蛋白产物造成细胞膜上出现分布规律的溶菌孔道,促使细胞内容物经孔道排出,最终导致细胞丧失活性。菌蜕不同于传统的灭活疫苗,其灭活方式没有经过高温或甲醛,而是在42℃时诱导表达溶菌基因E使细菌死亡,细菌表面的蛋白质等抗原成分没有变性,能保持相对较好的抗原性和免疫效果,菌蜕还具有固有的免疫佐剂性质和免疫系统靶向性质。它不仅可作为灭活菌苗,而且在作为递呈异源抗原、药物甚至DNA疫苗的载体方面也呈现出巨大的开发应用潜力,菌蜕技术已成为一个研究、开发新型基因工程疫苗的平台技术。本实验运用基因工程手段首次制备了鸭疫里默氏杆菌菌蜕（Riemerella anatipestifer ghosts）,与经传统灭活方法—甲醛灭活后的同源株灭活疫苗在相同条件下进行了雏鸭免疫保护试验,免疫试验结果证叫鸭疫里默氏杆菌菌蜕免疫效果优于甲醛灭活苗。鸭疫里默氏杆菌是一种非常难以转化的细菌,细胞壁较厚并且存在荚膜。可以通过制备鸭疫里默氏杆菌原生质体,以电转化的方式将溶菌质粒pBBRlys转化鸭疫里默氏杆菌原生质体,经筛选得到含有溶菌质粒pBBRlys的鸭疫里默氏杆菌。原生质体是指用酶学方法使细胞壁溶解后,释放出来的只有半透性胞质膜包裹着的球状体,它虽然没有了细胞壁,但仍然具有与完整细胞基本相同的生理、生化和遗传学特性,并且在合适的条件下能再生细胞壁,回复成一个完整的细胞。原生质休技术作为基因工程的手段之一,它可以直接作为外源DNA导入、质粒转移、病毒传递等的受体,以表达外源基因,从而具有相对的优越性,这对于那些难以电转化的细菌来说提供了一条新途径。培养鸭疫里默氏杆菌至OD600nm为0.7,在高渗缓冲液中,经溶菌酶（5mg/ml）于37℃作用50min,制备鸭疫里默氏杆菌原生质体;制备的原生质体与广宿主溶菌质粒pBBRlys混合,电转化法转化,电击参数设置为:15kV/cm-1,50μFd,150Ω,5ms,转化后再生于改良LB双层再生固体培养基（35μg/ml chloromycetin,Cm）,从而筛选到含有溶菌质粒pBBRlys的鸭疫里默氏杆菌。溶菌动力学试验中,28℃培养含有溶菌质粒pBBRlys的鸭疫里默氏杆菌至OD600nm约为0.33,升高培养温度至42℃,诱导45min后开始出现溶菌现象,约105min便基本结束诱导。溶菌灭活效率是99.9823%,鸭疫里默氏杆菌菌蜕经冷冻干燥后没有检测到活菌。在验证鸭疫里默氏杆菌菌蜕免疫效果的雏鸭保护试验中,分别经肌肉注射剂量达到2×109cfu/只的鸭疫里默氏杆菌菌蜕和鸭疫里默氏杆菌甲醛灭活苗（formalin killed vaccine,FKV）。免疫后第四周用两倍LD50同源株攻毒免疫动物。鸭疫里默氏杆菌菌蜕免疫组中免疫一次和免疫两次的相对保护率分别为62.5%,81.25%,而鸭疫里默氏杆菌甲醛灭活苗免疫组中免疫一次和免疫两次的相对保护率分别为43.75%,75%。所有免疫组死亡率均低于PBS对照组,差异显著,而它们的血清凝集效价高于对照组,同样也存在显著性差异。本实验制备鸭疫里默氏杆菌菌蜕用的是广宿主的溶菌质粒pBBRlys,溶菌质粒pBBRlys是本实验室构建的,采用的启动子是温度敏感型调控系统λpL/pR-cI857,该表达系统在28℃或28℃以下时,cI857会结合启动子区域,抑制溶菌基因E的表达;当培养温度高于28℃时,由于cI857的构象改变脱离启动子区域,溶菌基因E得以表达,在42℃时表达效率达到最高。该表达系统诱导方式简单、成本低。本文以原生质体技术和电转化技术为基础,构建了鸭疫里默氏杆菌菌蜕。不仅有充分的数据证明鸭疫里默氏杆菌细胞发生明显的溶菌。在免疫试验中,分别用鸭疫里默氏杆菌菌蜕和鸭疫里默氏杆菌甲醛灭活苗免疫模型动物,结果表明,鸭疫里默氏杆菌菌蜕免疫组免疫效果优于鸭疫里默氏杆菌甲醛灭活苗免疫组。对于鸭疫里默氏杆菌菌蜕的免疫效果,本文仅做了一个基础性研究,从中得出的结论是鸭疫里默氏杆菌菌蜕能够作为一种新型非变性灭活疫苗。