甘草(Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma)作为我国大宗药材,素有“十方九草”之称,随着现代药理研究的深入,甘草药材应用愈加的广泛,从而导致全球需求量急剧增加。然而,目前野生甘草资源的情况不容乐观,人工栽培甘草技术欠缺和影响因素过多,导致人工栽培甘草的质量和产量无法满足市场要求。因此在适当的栽培周期,采用人工干预方法是提高甘草质量和缓解市场需求的有效途径之一。本论文开展茉莉酸甲酯(MeJA)对甘草三萜类有效成分甘草酸和黄酮类有效成分甘草苷的积累及相关基因表达调控的研究,探讨MeJA对甘草根次生代谢的调控及其机制,为通过化学调控提高栽培甘草品质提供依据。同时根据研究结果在甘草次生代谢产物生物合成途径,选择GubAS基因进行克隆和构建表达载体,为后续获得转基因植株或转基因毛状根,研究该基因功能和培养甘草优良品种及生物技术途径生产甘草有效成分奠定基础。主要的研究方法及结果如下:1.MeJA对甘草有效成分积累的调控:分别用20、50、100μmol/L的MeJA处理6月龄甘草地上部分,每隔3天喷施一次,共喷施3次后取甘草根及根茎,利用HPLC测定甘草根中有效成分甘草酸和甘草苷的含量。MeJA溶液处理对甘草酸的积累有显著影响,特别是浓度为20、50μmol/L MeJA溶液处理效果极为显著。20、50μmol/L MeJA溶液对甘草苷的积累没有显著影响,而100μmol/L MeJA溶液处理则抑制了甘草苷的积累。由此表明适当浓度的MeJA能促进甘草根及根茎中甘草酸的积累,而对甘草苷的积累无效果或有抑制效果。2.MeJA对甘草次生代谢相关酶基因表达的调控:分别用20、50、100μmol/L的MeJA喷施6月龄甘草地上部分,处理后在2、6、12、24、36、72 h分别采收甘草根,采用实时荧光定量PCR法分析甘草根中甘草酸等三萜类成分生物合成相关酶β-香树脂醇合酶(GubAS)、β-香树脂醇-11-氧化酶(GubAO)基因和甘草苷等黄酮类成分生物合成相关酶6-脱氧查尔酮合酶(GuDOCS)基因的相对表达水平。20μmol/L的MeJA溶液处理甘草0~6 h对GubAS、GuDOCS基因的表达均有一定促进作用,处理2~6 h能提高GubAO的表达量。50μmol/L的MeJA溶液处理0~2 h对3个基因的表达水平都有提高作用,但该浓度的MeJA溶液处理6 h后对GuDOCS表达存在抑制现象。100μmol/L的MeJA溶液对GubAS和GubAO表达均无显著影响;100μmol/L的MeJA溶液处理甘草2 h时,GuDOCS表达量提高,随后逐渐下降并在处理24 h后出现抑制现象。试验结果表明中低浓度MeJA溶液在适当的处理时间对甘草酸的生物合成途径相关酶GubAS、GubAO基因的表达有上调作用,促进甘草酸的生物合成,但随着MeJA溶液浓度的提高和处理时间的延长,作用逐渐减弱。甘草苷生物合成途径相关酶GuDOCS基因表达量只在低浓度的MeJA溶液处理组中提高,浓度的增加和处理时间的延长会抑制GuDOCS的表达。由此表明,低浓度MeJA溶液在处理初期对甘草有效成分的积累及其生物合成途径相关基因的表达具有促进作用;而随着浓度提高或处理时间延长,MeJA溶液促进甘草有效成分积累及其生物合成途径相关基因表达的作用逐渐减弱,甚至产生抑制作用。3.GubAS克隆与表达载体构建:利用本课题组前期应用转录组测序技术获得的GubAS PCR扩增并构建全长cDNA克隆,将克隆质粒pMD-GubAS转化并双酶切获得全长cDNA片段GubAS,将该片段与相同限制性内切酶酶切并纯化的pBI121载体大片段连接获得重组表达质粒pBI-GubAS。通过PCR和测序验证插入序列的准确性,该表达质粒的构建为后续应用转基因技术获得甘草优良品种或生物技术生产甘草有效成分奠定了基础。