论文部分内容阅读
目的： 采用宫内窒息诱发新生鼠缺氧缺血脑损伤(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)模型,探讨线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive K+channels,mitoKATP)开放剂二氮嗪是否可通过稳定纤维形肌动蛋白(fibrous actin,F-actin)发挥对新生大鼠HIBD后的保护作用,为临床上开发mitoKATP通道开放剂治疗新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)提供实验依据。 材料与方法： 取孕21天Sprague Dawley(SD)大鼠麻醉后剖腹,结扎其子宫动静脉建立宫内窒息诱发新生大鼠HIBD模型,剖宫产取出的新生大鼠分为假手术组、窒息组、二氮嗪组、二氮嗪+格列苯脲组及溶剂组,其中假手术组仅行剖宫产术而不予结扎子宫动静脉。取出新生大鼠后0h、12h、24h分别腹腔注射相应药物。采用光学显微镜和电镜观察神经细胞组织学改变,2,3,5-氧化三苯基甲氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride monohydrate,TTC)染色试验方法及蛋白质印迹(western blot)方法分别观察HIBD后脑缺血情况及脑皮质F-actin蛋白表达情况。所有数据均以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS for Windows 17.0统计软件进行资料分析,采用单因素方差分析比较组间差异,各组间两两比较以最小显著差值法分析,P<0.05表示差别有统计学意义。 结果： 1.HE染色观察脑细胞损伤病理改变 假手术组脑细胞结构完整、排列有序,细胞周围间隙正常,细胞核清晰可见,胞浆染色均匀。窒息组细胞密度明显减低,排列紊乱,可见大量细胞水肿,神经元数目减少,部分区域可见大片细胞核固缩等坏死性改变及神经胶质细胞增生。二氮嗪组细胞排列较整齐,组织结构基本完整,大部分细胞核清晰可见,神经细胞的坏死及变性程度较窒息组明显减轻,可见部分神经细胞水肿。二氮嗪+格列苯脲组细胞密度减低,细胞周围间隙增宽,部分区域可见局灶性坏死。溶剂组细胞排列较紊乱,细胞密度减低,细胞核出现固缩、溶解表现,胞浆染色不均。 2.TTC染色观察脑缺血程度改变 宫内窒息剖宫产后24h新生大鼠出现明显脑缺血,脑片平均光密度明显降低(156.3±13.6),与假手术组相比(222.1±21.1)差异有显著性(P<0.01)。二氮嗪明显减轻脑缺血程度,脑片平均光密度显著升高(204.6±14.9),与窒息组相比差异有显著意义(P<0.01)。格列苯脲抵消了二氮嗪的脑保护作用,明显降低了脑片的平均光密度(166.8±17.2),与二氮嗪组相比差异有统计学意义(P<0.05)。 3.电镜观察神经细胞超微结构改变 假手术组细胞内线粒体、粗面内质网和高尔基体均很清楚,线粒体数量多,结构清楚,嵴排列规整。窒息组线粒体数目明显减少,线粒体结构模糊不清,嵴紊乱、缩小和部分消失,线粒体出现空泡样改变,粗面内质网脱颗粒,高尔基复合体裂解。二氮嗪组神经细胞结构基本正常,粗面内质网和高尔基体尚清楚,较多线粒体结构相对完整,部分线粒体稍肿胀,基质减少,嵴排列稍不规整。 4.western blot结果 窒息组皮质F-actin蛋白量明显低于假手术组(P<0.01);二氮嗪干预后皮质细胞骨架崩解减少,F-actin蛋白量增加,与HI组相比有显著差异(P<0.01);格列苯脲可逆转二氮嗪对细胞骨架的稳定保护作用,细胞骨架崩解增加,F-actin蛋白量与二氮嗪组相比有统计学意义(P<0.01)。 结论： 1.宫内窒息后新生大鼠出现明显的缺氧缺血脑损伤,表现在:细胞形态出现明显的病理改变如细胞水肿、变性及坏死;脑缺血程度严重;细胞超微结构如线粒体、高尔基体、内质网等结构破坏或消失;细胞骨架F-actin蛋白降解。 2.窒息新生大鼠经mitoKATP通道开放剂二氮嗪干预后,细胞变性、坏死程度减轻,脑缺血程度得到明显减轻,线粒体形态改善,提示对宫内窒息诱发的缺氧缺血脑损伤有明显保护作用。 3.mitoKATP通道开放剂二氮嗪可减轻皮质部位细胞骨架蛋白F-actin的降解,且这种保护作用可被mitoKATP通道抑制剂格列苯脲所抵消,提示二氮嗪对缺氧缺血性脑损伤的保护作用是通过开放mitoKATP通道而起效的,推测mitoKATP通道的开放可稳定细胞骨架从而减少其降解进而来达到脑保护作用。