[背景]甲基苯丙胺(methamphetamine, MA)是苯丙胺类毒品中滥用最为广泛的一种。在药物依赖和滥用日渐严重的今天,MA有可能取代吗啡和大麻成为21世纪危害最大的毒品,因此MA滥用已经成为一个世界性的社会问题。.大量实验和临床资料表明,MA除可产生精神作用和神经毒性作用外,还可引起心血管、消化、内分泌、泌尿和生殖统疾病的发生,其中最重要的是心血管疾病。MA引起的心血管系统疾病和并发症,可能是多数MA滥用者的死亡原因。因此MA的心血管毒性作用研究逐渐成为相关研究的重点和热点。MA可引起多种心血管疾病的症状,尸检亦发现MA存在心脏毒性,认为其死亡原因为MA对心脏产生毒性作用所致。目前国内外关于MA的心脏毒性研究主要集中于MA对心肌线粒体的损伤,也有实验发现MA可使线粒体内膜膨胀、内嵴消失,诱导线粒体膜间隙的细胞色素C释放至胞质后触发Caspase级联,导致细胞死亡。因此,普遍认为MA的心肌损伤的形成,可能与细胞线粒体死亡途径有关。但在国内外心脏毒性研究领域仍存在许多尚未明确的地方,主要表现为：①目前普遍认为MA可能诱发心肌损伤,但迄今为止,缺乏MA诱导心肌细胞凋亡的直接证据；②目前认为MA对心肌细胞的损伤可能与Caspase级联反应有关,但Caspase是凋亡较为下游的调控蛋白,其上游与凋亡有关基因在MA心肌细胞毒损伤中的作用则国内外均未有过报道。所以,研究MA的心肌毒性作用,讨论MA的心肌损伤机制具有重要的研究价值。[目的]通过证实MA可诱导心肌凋亡,来证明MA的心肌毒损害,并研究心肌细胞中Fas、FasL和Bax、Bcl-2凋亡调控基因表达的变化,分析MA诱导心肌损伤可能的机制。[方法]1.复制MA中毒动物模型：按照急性、亚急性和慢性毒性动物实验的原则,复制MA中毒动物模型。按3mg/kg体重,经腹膜下注射方式给药,每日1次。对照组大鼠采用等体积生理盐水代替。急性组注射3d,亚急性组连续给药2w,慢性组连续给药8w。2. MA中毒大鼠心肌细胞凋亡检测：用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)原位标记凋亡细胞核,观察比较急性、亚急性、慢性MA中毒大鼠心肌凋亡细胞变化。3.对MA中毒大鼠心肌细胞Fas、FasL和Bax、Bcl-2进行免疫组化染色,观察急性、亚急性和慢性组染色变化。4.对MA中毒大鼠心肌细胞Fas、FasL和Bax、Bgl-2 mRNA进行RT-PCR检测,对比分析急性和亚急性组Fas、FasL和Bax、Bcl-2 mRNA变化情况。[结果]1.TUNEL染色部分对照组中仅见极少数或未见凋亡细胞,急性组、亚急性组和慢性组心肌中凋亡细胞出现或增多,呈散在分布,无明显特点。急性组、亚急性组和慢性组随着用药时间的延长,凋亡细胞阳性指数逐渐增高。急性组合亚急性组之间无显著性差异(P>0.05),但两组与慢性组相比较,存在显著性差异(P<0.05)。2.Fas.FasL和Bax.Bcl-2免疫组化染色部分与对照组相比,各实验组Fas和FasL均有显著性增高(P<0.05),各实验组间实验数据的对比分析,发现慢性中毒组的Fas和FasL最高,亚急性中毒组较急性中毒组为低,且亚急性组与急性组之间无显著性差异(P>0.05)。通过各实验组间实验数据的对比分析,发现急性组、’亚急性组和慢性组Bax和Bcl-2的升高与对照组均存在显著性差异(P<0.05),且均随实验时间延长逐渐增加,其中不同的是亚急性组Bax/Bcl-2比值比急性组略低,但差异不显著。3RT-PCR部分与对照组相比,急性中毒组和亚急性中毒组Fas和FasL mRNA表达均上升(P<0.05),且亚急性组FasL mRNA表达较急性组略降低,但急性中毒组与亚急性中毒组之间差异不显著(P>0.05)与对照组相比,急性中毒组和亚急性中毒组Bax和Bcl-2 mRNA表达均显著性高于对照组(P<0.05)。Bcl-2呈逐渐上升趋势,亚急性组Bcl-2高于急性组。Bax和Bax／Bcl-2比值均表现为急性组升高,亚急性组降低,且亚急性组Bax/Bcl-2低于对照组。[结论]1.MA与心肌细胞凋亡MA可以诱导心肌细胞发生凋亡,MA所诱导的心肌细胞凋亡,可能是MA心肌毒损伤的重要途径。认为使用MA3d和2w之间有差异,但损伤差异不显著,而长期使用MA则可引起严重的心肌损伤。2.MA诱导心肌细胞凋亡与Fas.FasL和Bax.Bcl-2的关系(1)MA对Fas.FasL和Bax.Bcl-2的影响急性组、亚急性组和慢性组Fas.FasL和Bax.Bcl-2均有不同程度的变化,表明MA可通过调节Fas.FasL和Bax.Bcl-2表达,从而诱导心肌细胞凋亡,认为Fas.FasL和Bax、Bcl-2参与了MA诱导心肌细胞凋亡。(2)免疫组化部分随着使用MA时间的延长,Bcl-2表达逐渐增高,而亚急性组Fas和FasL比急性组稍降低,且TUNLEL染色显示亚急性组凋亡细胞与急性组无显著性差异,故认为在MA诱导心肌细胞凋亡中Fas、FasL受到Bcl-2的负调节。随着使用MA延长至8w,心肌凋亡细胞较亚急性组又为增高,Fas和FasL也显著性增高,而同时Bcl-2增高相对较少,Bax/Bcl-2比值显著降低,提示随着使用MA时间延长,Bcl-2的负调节作用再次减弱。(3)RT-PCR部分与免疫组化结果相比,各目的基因表达情况略有不同,Bcl-2 mRNA的检测结果与之一致,均为亚急性组高于急性组,更高于对照组。Bax mRNA则表现为,随使用MA时间延长呈先增高、后降低的趋势,但总体而言仍高于对照组。Bax的免疫组化染色结果提示,Bax在亚急性组仍较急性组为高,只是上升不显著。认为在使用MA达2w时,Bax已经显示出逐渐减慢、甚至下调的趋势,故反应在Bax/Bcl-2比值上,则表现为显著性下调,甚至低于对照组。TUNEL染色结果表明,MA可诱导心肌细胞发生凋亡,且随着使用MA时间的延长,凋亡细胞逐渐增多,但在3d和2w组之间的差异不显著,通过前实验对Fas、FasL和Bax、Bcl-2免疫组化染色和RT-PCR检测,发现在3d和2w组之间,上述Fas、FasL和Bax、Bcl-2基因表达表现出上调、下降等不同趋势,而不再简单的表现为逐渐上升或逐渐下降,表明随着使用MA时间的延长,机体对MA逐渐出现一定程度的耐受和自我调节,尤其是抑凋亡基因Bcl-2在两组内、不同方法间呈现一定的差异,认为Bcl-2的表达可能在机体自我调节和修复中起到了非常重要的作用,可能是影响MA诱导心肌细胞凋亡中非常重要的因素。在慢性组中,由于MA使用时间较长(达8w),心肌凋亡细胞又再次显著性增多,对Fas、FasL和Bax、Bcl-2免疫组化染色结果提示,各凋亡相关基因表达再次显著性增高,提示在使用MA时间延长到一定程度时,MA对心肌的损害已经超过了机体自我调节和修复能力,凋亡细胞和凋亡相关基因的表达再次显著性增高。