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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)可以产生多种杀虫蛋白,如营养期的Vip蛋白和芽胞期形成的Cry晶体蛋白。由于Bt杀虫蛋白对鳞翅目、鞘翅目和双翅目等多种害虫具有特异的杀虫效果,因此被广泛用于转基因作物中。然而在转Bt作物的广泛种植过程中,其显著的抗虫效果被靶标昆虫所产生的抗性日益削减。而两种或多种Bt蛋白组合不仅能有效克服或延缓靶标害虫对Bt蛋白抗性的产生,而且能扩大杀虫谱;其中,特定的蛋白组合还能产生协同增效作用,显著提高杀虫活性。在前期研究中发现Cry9Aa和Vip3Aa蛋白组合对水稻二化螟(Chilo suppressalis)具有显著的协同增效杀虫效果。但迄今为止全世界范围内关于Cry和Vip蛋白之间的增效作用机制的研究仍为空白。本研究首先对Cry9Aa和Vip3Aa蛋白对水稻二化螟的协同增效杀虫机制进行了深入的研究,在此基础上,开展了对玉米害虫高效的Bt蛋白组合筛选,主要进展如下:1.证明了Cry9Aa和Vip3Aa蛋白与BBMV存在特异性结合;明确了Cry9Aa和Vip3Aa蛋白在BBMV上存在不同的受体结合位点。2.发现了Cry9Aa和Vip3Aa两种蛋白之间可以通过很高的亲和力特异性结合。3.明确了Cry9Aa蛋白通过结构域Ⅱ和Ⅲ与Vip3Aa蛋白结合。进一步发现Cry9Aa结构域Ⅱ-loop 3的RRS495-497AAA突变体与Vip3Aa蛋白的结合明显减弱。通过将Cry9Aa合成重叠多肽再次印证了Cry9Aa-495RRS497区域与Vip3Aa蛋白存在结合。另一方面,为了明确Vip3Aa中参与和Cry9Aa蛋白互作的关键位点,发现了Vip3Aa的Lys352-Asp451区域与Cry9Aa存在结合。进一步发现其中两个肽段356-ALIGFEISNDS-366和428-TKKMKTL-434参与了和Cry9Aa蛋白的结合。通过氨基酸定点突变得出Vip3Aa-432KTL434AAA突变体与Cry9Aa的结合能力显著降低。最后通过对水稻二化螟的增效杀虫活性测定证实,Cry9Aa-495RRS497AAA和Vip3Aa-432KTL434AAA突变体蛋白的增效杀虫活性明显下降。这些结果证实了Cry9Aa和Vip3Aa蛋白之间的相互作用引发了协同增效杀虫作用。4.在上述研究的基础上,通过筛选对玉米害虫有协同增效杀虫作用的Bt蛋白组合,发现了Cry9Aa和Vip3Aa蛋白同样对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)有一定的增效作用,而Cry1Bb和Cry9Ee蛋白对东方粘虫(Mythimna separata)也有一定的增效活性。同时还发现亚洲玉米螟对Cry9Ee与Cry1Ab蛋白不存在交互抗性,其机制可能是两种蛋白在亚洲玉米螟的BBMV上不存在竞争结合。本研究阐明了Cry9Aa和Vip3Aa蛋白与BBMV存在特异性结合并具有不同的受体结合位点是协同增效杀虫作用的前提,在此基础上,两种蛋白之间的相互作用直接引发了增效杀虫活性。这一发现不仅完善了多Bt蛋白杀虫作用机制,并且为两种蛋白在“Pyramids”转基因作物中的应用奠定了理论基础。此外,Cry9Aa和Vip3Aa蛋白结合位点的明确,则为获得高效Bt蛋白的定向改造提供了理论支撑。