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虾青素是一种抗氧化活性极强的类胡萝卜素,具有广泛的应用价值。雨生红球藻是自然界虾青素含量最高的生物,能在逆境胁迫条件下大量合成并积累虾青素,其虾青素积累量可高达细胞干重的4%。但生物量提高与虾青素积累的矛盾限制了虾青素的规模化生产,因此通过基因工程手段改造雨生红球藻的生物学特性,提高其生长速度和虾青素含量具有重要意义。
本研究克隆了虾青素合成过程中的关键酶——IPP异构酶基因,利用建立的农杆菌侵染转化体系和基因枪法将ipiHp1基因导入雨生红球藻细胞内,分析过表达IPP异构酶基因的雨生红球藻株生物量及虾青素含量的变化。主要研究成果如下:
1.建立了农杆菌介导的雨生红球藻遗传转化的筛选体系,将外源荧光蛋白egfp基因转入雨生红球藻体内并成功表达。检测了转化子的生物量和虾青素含量,结果表明与野生型雨生红球藻无显著性差异,证明该方法可用于后续的雨生红球藻基因工程改造。
2.利用RT-PCR技术克隆了ipiHp1基因,利用农杆菌介导法将双元载体pCAMBIA3300-egfp-ipiHp1转入雨生红球藻体内,鉴定表明ipiHp1基因已整合到转化子的基因组DNA中,同时检测了转化株虾青素含量的变化,检测发现转化株A3的虾青素含量与野生型有显著差异(P<0.05),平均值达到16.49mg/g,比野生型提高了5.16%,为构建高产虾青素的基因工程藻株奠定了基础。
3.构建了基因枪转化载体pBlueScript SKⅡ-bar-egfp-ipiHp1,利用基因枪转化法转入雨生红球藻细胞内,荧光观察及PCR验证发现目的基因已插入到转化子的基因组DNA中,检测了转化子虾青素含量的变化,统计学分析表明转化株虾青素含量与野生型无显著性差异(P>0.05)。
本研究构建的表达载体和建立的农杆菌转化体系为雨生红球藻的转基因研究奠定了基础,具有重要应用价值。