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目的:
上皮间质转化在肿瘤侵袭和转移中扮演重要角色。EMT的关键特征之一就是细胞连接蛋白E-cadherin的表达下调伴随间质特征的获得。
E-cadherin是一个分子量为135kD钙粘蛋白，由CDH1基因编码，位于染色体16q21。在肿瘤的进展过程中，E-cadherin可通过多种机制功能性的沉默或失活，包括机体突变，翻译后修饰和转录抑制。
Slug来自snail超家族，是转录因子之一。它最早在神经脊中被确认，并在人类多种类型肿瘤中的研究都发现其下调上皮标记物，上调间质标记物以使肿瘤细胞变得更具活动力和侵袭力。
胸腔积液是疾病常见并发症之一，通常可作为临床诊断的早期临床体征。我们利用胸水提取肿瘤细胞，研究slug和E-cadherin的表达，探讨两者在肺腺癌中表达的相关性。
材料与方法:
1、材料
收集2008年12月至2010年2月中国医科大学附属第一医院门诊及病房恶性胸水患者标本，优选以肿瘤细胞为主、炎性细胞较少未接受过治疗的121例作为研究对象（经细胞免疫化学及临床资料证实为肺腺癌细胞）。另外28例良性胸水标本作为对照，共计149例。其中，男性患者69例，女性患者52例；年龄26-89岁，平均年龄56岁。
2、免疫细胞化学染色
兔抗人E-cadherin抗体购自美国abcam公司，鼠抗人slug抗体购自美国santa cruz抗体试剂公司产品，鼠抗人vimentin抗体购自福州迈新公司销售的美国Biox公司产品。采用链霉菌抗生物素-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法，PBS缓冲液代替第一抗体作为空白对照，DAB显色，苏木素复染。常规脱水透明，中性树胶封片。
3、液基细胞薄层检测技术(TCT)：
收集新鲜胸水20ml左右，室温下800r/min离心5分钟，弃去上清，取沉淀底层细胞，加入清洗液后再次离心。取沉淀与保存液混合后机器Thinprep2000自动制片。
4、免疫荧光染色方法
采用间接免疫荧光染色法检测slug和E-cadherin的表达定位。首先，TCT涂片放入4％福尔马林中固定20分钟。加非免疫动物血清37℃封闭30分钟，滴加一抗(1:100稀释)，4”C孵育过夜；免疫荧光二抗(1:100稀释)，37″C孵育30分钟。DAPI复染细胞核。50％缓冲甘油封片，荧光显微镜Nikon90i下观察并照相。孵育二抗以后步骤均在避光条件下进行。阴性对照实验：用等量的0.01mol/L PBS代替一抗，其余步骤同前。结果判定：以细胞中呈现明亮的绿色荧光信号定位Oct3/4阳性。
5、Western Blot蛋白印迹
为了检测EMT总体水平，在40例胸水标本中检测slug，E-cadherin和Vimentin的蛋白水平。总蛋白从胸水细胞中提取，冰上超声处理，4℃静置，孵育50min，4℃离心20min(800r/min)，提取上清，放入-70℃冰箱里保存。使用前，用Brodford法测定蛋白浓度，以每孔80μg蛋白加入10％SDS-PAGE凝胶电泳后，4℃，50V(slug)、100V（E-cadherin）条件下湿电转移仪将蛋白转入0.22μmPVDF膜，5％脱脂奶粉封闭液封闭2h，一抗（slug1:100稀释，E-cadherin1:1000稀释）4℃过夜，X底片曝光，显影，定影后拍照，以β-actin为内参，用凝胶成像及分析系统（BioImaging Systems，美国）分析蛋白各条带的灰度值，每组结果均为相同条件重复3次。Western blotting试验中使用的试剂包括：E-cadherin单克隆抗体(＃4065) and Slug单克隆抗体(sc-130404)分别购自Cell Signaling Technology和Santa Cruz Biotechnology抗体公司。Ⅵmentin鼠抗人单克隆抗体(Clone ID:V9)购自福州迈新生物技术公司。
6、统计分析
各组资料利用SPSS for Window13.0进行统计分析。p＜0.05有统计学意义。
结果:
免疫荧光染色及免疫细胞化学结果显示slug蛋白在肺腺癌细胞中主要为核表达，部分有胞浆表达。E-cadherin蛋白在肺癌细胞膜上呈高表达。Vimentin蛋白呈胞浆表达。slug蛋白、E-cadherin蛋白及Vimentin蛋白在肺腺癌细胞中的表达率分别为43/121(36％)，87/121(72％)和102/121(84％)。对于恶性胸水标本，slug与E-cadherin表达呈相反的趋势。Slug在胸水中肺腺癌细胞的表达的增强往往伴随E-cadherin的表达下降及Vimentin的表达。Slug和E-cadherin在增生上皮细胞中阴性表达。Slug的表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位及临床分期无关(P＞0105)。
结论:
slug与E-cadherin在胸水中肺腺癌细胞中的表达呈负相关(P＜0.05)，在胸水中提取肺腺癌细胞，研究slug的表达及其在上皮间质转化中的调节作用对探讨肿瘤细胞在人体中的转移进展很有意义。