论文部分内容阅读
目的:目前HIV血液筛查最常用的方法为ELISA。国内检测HIV的主流方法为第三代HIV ELISA检测试剂,第三代试剂应用双抗原夹心法,检测HIV不同的抗体亚型HIV-1/2/OIgG/M/A,改善了 O群标本的反应性,酶标记物由特异性HIV-1抗原取代抗人IgG,其检测的灵敏度和特异性高于第一、二代试剂,窗口期缩短至22天,然而国内外一些研究发现由于HIV ELISA试剂在同一反应孔中同时检测多种抗体,产生了相互的空间位阻造成了免疫反应的相互干扰,影响了检测的灵敏度和特异性。经ELISA初复检HIV阳性标本必须经过western blot确认实验才能报告HIV抗体阳性。本文采用液相芯片检测技术进行HIV-1 gp41、gp120、p24抗体的独立、同时检测,同时增加HIV-1p17、p31、p66抗体验证此方法的准确性,并且实验结果与western blot结果比较。液相芯片检测技术具有较高检测的灵敏度和特异性,已经在国内外科研、临床检测得到了广泛的应用。通过液相芯片法使HIV-1检测的灵敏度和特异性显著高于目前国内外HIV-1常规检测试剂。方法:本研究通过利用基因克隆技术,用PET原核表达载体表达HIV-1中国流行株CRF01-AE的p17、p24、p31、p66抗原,并经亲和层析技术纯化。将HIV-1 gp41、gp120、p17、p24、p31、p66抗原分别与带有不同荧光信号的微球结合(50#、56#、65#、71#、77#、83#),将生物素化二抗作为指示分子,组成HIV-1gp41、gp120、p24三种抗体的独立、同时检测,同时增加HIV-1p17、p31、p66抗体验证此方法的准确性,六组荧光免疫反应构成一个液相芯片多重抗体荧光免疫反应系统。通过Luminex-200液相芯片检测仪检测每组微球的平均荧光强度,对经western blot确认HIV-1阳性标本、HIV-1抗体不确定标本以及HIV-1阴性标本分别进行定性、定量分析。结果:1.成功扩增出了 HIV-1p17、p24、p31、p66基因片段,酶切鉴定、大肠杆菌BL21表达SDS-PAGE结果显示表达蛋白分子量大小与预期蛋白分子量大小一致。2.对包被微球与血清标本的最佳反应时间、生物素化二抗的最佳反应浓度、SA-PE的最佳反应浓度、最佳反应方式等实验条件进行了优化。实验全程大约2.5小时,与WB试验相比,很大程度的缩短了检测时间,方法更简便快捷,并且具有高通量的优点。3.Luminex-200检测结果显示:1)根据阴性标本的MFI确定六种微球(50#、56#、65#、71#、77#、83#)MFI的 cut-off 值分别为 897.67、788.32、1055.52、909.77、798.55、989.44。2)发现50份经WB确认HIV-1抗体阳性,Luminex检测结果显示50份标本也同样为阳性。3)5份WB HIV-1抗体不确定标本(13号、14号、25号、31号和51号)中LuminexHIV-1抗体阳性3份(13号、31号和51号),HIV-1抗体不确定2份(14号和25号);4)1份ELISA初复检HIV-1阳性标本(42号标本),WB检测为阴性(漏检),而Luminex结果为HIV-1抗体不确定;5)同时对5份WB检测HIV-1抗体不确定标本和1份ELISA初复检HIV-1阳性WB HIV-1检测阴性标本同时加增了 HIV-1 RNA核酸检测,这6份标本HIV-1 RNA核酸均为阳性。6)92份ELISA阳性WB阴性结果中85份Luminex结果判定为阴性;三份Luminex结果判定为阳性结果,四份为不确定结果。7)49份ELISA检测HIV阴性标本Luminex结果均为阴性。结论:成功扩增出HIV-1p17、p24、p31、p66四个目的片段,表达纯化出了HIV-1四种较高纯度的抗原;建立了 HIV-1抗体液相芯片反应系统,优化出了最佳的实验条件;解决了 HIV第三代ELISA检测试剂检测特异性低的问题,试验特异性优于WB试验;同时液相芯片反应系统具有标本用量少、反应时间短、节约成本、操作简单等优点,具有较强的临床检测价值。