背景:多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)是一种常见的中枢神经系统自身免疫性疾病,随着神经退行性病变和炎症反应的发生,病人出现间歇性神经功能障碍,并且逐渐表现出视神经炎、肢体瘫痪、感觉障碍、平衡和协调困难、认知及睡眠障碍等典型的临床症状。多发性硬化的发病原因目前还不明确。在疾病治疗方面,迄今为止,尚未发现可以彻底治愈MS的药物,常用的治疗药物主要集中于免疫调节和免疫抑制剂等治疗方面。这些药物虽然可以在一定程度上缓解病情,降低复发率,但治疗效果并不令人满意,而且几乎所有药物都有严重的副作用。因此,寻找一种更有效、安全、便利及彻底根治的药物,是当前研究MS治疗亟待解决的根本问题。Vitamin D在调节机体内钙稳态方面的作用已广为人知。近年来,Vitamin D在免疫系统疾病方面的应用逐渐成为热点。流行病学调查发现,光照与MS发病率之间具有密切的相关性,而光照是生物体内Vitamin D合成的催化剂,因此,人们推断,光照影响了机体内Vitamin D水平,从而影响MS的发病率。随后的实验发现,MS病人体内25-(OH)D3的含量明显低于正常人,说明人体内Vitamin D 含量与 MS 的病程有显著关联。EAE(experimental autoimmune encephalomye-litis,一种常用的MS动物模型)动物实验发现饮食补充Vitamin D可以有效推迟EAE发病时间,缓解病情(本课题组的动物实验也得到了相同的实验结果)。这些实验结果皆说明,Vitamin D与MS的发生和发展有显著的相关性。然而,Vitamin D在MS/EAE的保护性机制仍不明确。故此,研究其间的作用机制,对于Vitamin D应用于MS的预防和治疗具有重要意义。凝溶胶蛋白(GSN)是人体内表达最广泛的肌动蛋白清除蛋白。它存在两种亚型:定位在血浆及脑脊液(CSF)中的血浆凝溶胶蛋白(pGSN)和定位在胞浆中的胞浆凝溶胶蛋白(cGSN)。pGSN主要的功能是参与细胞外肌动蛋白清除,也可与炎性介质相互作用。cGSN主要在细胞运动性以及细胞凋亡调控等方面发挥重要作用。已有报道,在MS病人和EAE动物模型血液中GSN表达量明显降低,本课题组的前期研究发现,在EAE大鼠发病过程中pGSN,cGSN的含量都随EAE的病程而改变,两者都在EAE发病过程中起到了保护性的作用。然而,本课题组前期研究还发现,补充Vitamin D的EAE大鼠体内(不论EAE发病与否),GSN的含量均有明显下降,这提示我们,Vitamin D在预防和治疗EAE中作用有限的原因可能是其下调了 GSN的含量。基于以上设想,在本研究中,我们采用向EAE大鼠体内注射GSN过表达病毒(LV-GSN)的方法提高EAE大鼠体内GSN的表达量,以此观察GSN在EAE发病过程中是否具有保护性。结果发现,提高EAE大鼠体内GSN的含量可明显推迟EAE的发病时间,缓解病情。而相比单独补充VitaminD或注射(LV-GSN)的EAE大鼠而言,在补充VitaminD的同时注射LV-GSN的EAE大鼠,EAE的起始发病时间更晚,病情评分更低。这说明,VitaminD对GSN的下调确实可能削弱了其对EAE的保护作用。通过在PC12细胞(一种神经元研究常用的大鼠细胞系)中基因干扰和过表达的方法,我们发现,VitaminD对GSN的调控可能是通过Vitamin D在细胞内的受体——Vitamin D受体(VDR)来实现的。功能学实验证实,cGSN确实在细胞凋亡过程中起保护性作用。此外,为系统研究Vitamin D在预防和治疗EAE中的作用机制,我们还利用定量蛋白质组学方法(iTRAQ)对EAE诱导前后以及Vitamin D补充前后的EAE大鼠脊髓中的差异表达蛋白进行了筛选,结果发现,与对照组(未诱导EAE的正常组)大鼠相比,EAE急性期大鼠脊髓内有722种蛋白质的表达发生了改变(筛选标准为:表达差异倍数大于1.2倍且P-value小于0.05);而与未补充Vitamin D的EAE急性期大鼠相比,补充Vitamin D的EAE急性期大鼠脊髓内有184种蛋白质的表达发生了改变(筛选标准为:表达差异倍数大于1.2倍且P-value小于0.05)。而在EAE发病前后和Vitamin D补充前后的大鼠脊髓内均发生表达改变的蛋白质有44种。经生物信息学分析,这些蛋白多参与细胞的结构组成,细胞的生长,细胞凋亡等过程。后续的Western Blot实验验证热休克蛋白27(Heat shock 27 kDa protein 1,Hsp27)和凝集素3(Galectin-3,Gal-3)均在EAE急性期有增加(与对照组相比)。这与iTRAQ结果相一致。总之,本研究主要探讨了 GSN在Vitamin D预防和治疗EAE作用中的可能的影响机制,筛选了可能受Vitamin D调控的与EAE发病进程有关的蛋白。我们的实验结果证明了 GSN在EAE发病过程中起到保护性的作用,首次证明在补充Vitamin D同时提升GSN的表达量可显著增强Vitamin D预防和治疗EAE的效果;Vitamin D可能通过其受体VDR调控GSN的表达。同时我们还为系统研究Vitamin D预防和治疗EAE的作用机制提供了 Hsp27、Gal-3等候选蛋白和新思路,推动了 Vitamin D在MS治疗的临床应用进程。第一部分GSN对Vitamin D预防和治疗EAE/MS作用影响的研究目的:阐明GSN对EAE病程的影响,证实在补充Vitamin D的同时关注GSN表达水平的提升可能起到更好的治疗EAE的效果,为更好的发挥Vitamin D在预防和治疗MS中的作用,提供新的思路和实验依据。方法:1.收集患有MS和其他神经系统疾病(OND)病人的血液和脑脊液(CSF),利用Western blot技术分析其中GSN表达量的变化。2.构建大鼠EAE模型:将碱性髓鞘蛋白的生理盐水溶液(MBP,1mg/ml)和完全弗氏佐剂(CFA,含5mg/ml的卡介苗)按1:1的比例等体积的充分混合,向Lewis大鼠的双后足垫皮下注射,诱导EAE模型;对照组大鼠,注射含有除MBP之外其他物质的匀浆。自免疫之日(记为第0天)起,每天记录大鼠的体重和病情评分,直至第25天。第13天时,从EAE免疫组和对照组大鼠中各随机抽取三只进行心脏灌注,然后取大鼠脊髓进行组织切片和病理学染色(H&E),观察脊髓内炎性细胞浸润情况。模型是否构建成功从大鼠体重,病情评分和炎性细胞浸润情况三个方面来评估。3.LV-GSN的注射及Vitamin D的补充:取48只Lewis大鼠,根据是否诱导EAE分为两组:正常组(C)和EAE发病急性期组(E);然后每个组根据是否注射LV-GSN和是否补充Vitamin D或者两者同时处理分为4组,这样48只大鼠被分为八组:C,GC,VC,VGC,E,GE,VE,VGE组,每组6只。注射GSN组(GC,VGC,GE,VGE)在免疫后第3天向大鼠脑室和尾静脉注射LV-GSN病毒,其余组注射对照病毒。补充Vitamin D组(VC,VGC,VE,VGE)隔一天向大鼠喂食一次含有维生素D(3μg/day)的饲料,共持续两周。并每天观察记录各组大鼠的发病时间,评分情况,第12天处死大鼠,检测脊髓内炎性浸润情况。4.为确定Vitamin D是否被有效的吸收,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法,测定各组大鼠血清中1,25-二羟基维生素D3和25-羟基维生素D3的含量。为确定LV-GSN是否成功提升大鼠体内的GSN表达量,利用Western Blot技术,检测LV-GSN注射后大鼠血液和脊髓内GSN的表达。5.Western Blot和qRT-PCR检测各组大鼠体内GSN和VDR的在mRNA水平和蛋白水平的表达情况。6.Western Blot检测梯度浓度1,25(OH)2D3刺激后PC12细胞内GSN和VDR的表达情况。7.PC12细胞内干扰和过表达VDR后,Western Blot检测GSN的表达量,观察GSN的表达是否受VDR的调控。8.PC12细胞内干扰和过表达GSN后,Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况,分析cGSN与细胞凋亡的关系。结果:1.MS病人CSF中GSN的含量明显低于ONDs病人。2.成功构建大鼠的EAE模型:第9天左右EAE大鼠体重开始下降,15天左右体重达到最低,随后开始逐渐恢复,而正常大鼠体重随时间而逐渐增加;评分方面:EAE大鼠从第9左右天开始出现尾巴无力的症状,第12天评分达到最高值,而后评分逐渐降低,第18天左右症状完全消失;H&E染色结果发现在EAE大鼠脊髓中有明显的炎症浸润。3.注射LV-GSN可明显推迟EAE大鼠的起始发病时间,减少炎性损伤,降低疾病评分。而补充Vitamin D和注射LV-GSN联合使用时,相较两者单独使用而言,EAE的发病起始时间最晚,评分最低,炎性损伤最少。4.Vitamin D被有效的吸收:补充Vitamin D组大鼠血清中25-羟基维生素D3和1,25-二羟基维生素D3的含量明显高于未补充Vitamin D组。LV-GSN成功在大鼠体内表达:LV-GSN注射后大鼠血液和脊髓内GSN的表达量明显高于注射对照病毒组。5.EAE发病后GSN和VDR的表达量都有明显降低,Vitamin D的补充可增加VDR的表达量而降低GSN的表达量。6.随1,25(OH)2D3浓度的增加,GSN表达量逐渐降低,VDR含量逐渐增加,50nM浓度时效果明显。7.Vitamin D可能通过VDR调节GSN的表达:VDR干扰后,GSN表达量增加,而VDR过表达后,GSN表达量降低。8.cGSN在神经元凋亡过程中起抗凋亡作用:干扰cGSN后,细胞凋亡率明显升高;过表达cGSN后细胞凋亡率降低。结论:1.过表达EAE大鼠体内GSN的含量可显著推迟EAE的起始发病时间,缓解EAE病情;2.在补充Vitamin D 同时提升GSN的表达量可显著增强Vitamin D预防和治疗EAE的效果,Vitamin D下调GSN的表达量,可能是Vitamin D治疗MS作用有限的一个重要原因;3.Vitamin D可能通过其受体VDR调控GSN的表达。第二部分EAE大鼠发病过程中可能受Vitamin D调节的差异蛋白的蛋白质组学筛选研究目的:筛选EAE诱导前后以及Vitamin D补充前后的EAE大鼠脊髓中的差异表达蛋白,为系统研究Vitamin D预防和治疗EAE/MS的作用机制提供新的候选蛋白和新的思路。方法:1.EAE大鼠模型的构建和Vitamin D的补充:取30只Lewis大鼠,根据诱导EAE与否分成对照组(C组,10只)和EAE组(20只),其中EAE组又根据补充Vitamin D与否分成补充Vitamin DEAE组(VE组,10只)和未补充Vitamin DEAE组(E组,10只)。EAE诱导和Vitamin D的补充方法同第一部分。2.利用同位素标记的相对和绝对定量(iTRAQ)蛋白质组学方法分析EAE诱导前后以及Vitamin D补充前后的EAE大鼠脊髓中的差异蛋白:在EAE大鼠发病急性期(第12天)处死各组大鼠,分别取脊髓提蛋白,蛋白定量后,酶解得到肽段。iTRAQ标记肽段,SCX分级后进行梯度Q-exactive分析,共计15次LC-MS/MS分析,得到原始质谱数据,然后通过分析软件Proteome Discoverer进行数据库检索获得差异表达蛋白。3.筛选在EAE发病前后和Vitamin D补充前后的大鼠脊髓内均发生表达变化显著的蛋白.4.通过基因本体(GO)功能注释,KEGG等生物信息学途径,分析差异蛋白功能属性,所在通路,和相互间作用网络等相关信息。5.利用Western Blot方法确认Hsp27、Gal-3在EAE大鼠脊髓中的表达变化情况,说明Hsp27、Gal-3的表达量确实与EAE病程有关且受到Vitamin D的调节。结果:1.原始数据中,经质谱定性鉴定,总共发现有4987种蛋白。其中E组和C组之间(E/C)有722种蛋白质的表达发生了改变(筛选标准为:表达差异倍数大于1.2倍且P-value小于0.05),上调的有438种,下调的有284种;VE组与E组之间(VE/E)有184种蛋白质的表达发生了改变(筛选标准为:表达差异倍数大于1.2倍且P-value小于0.05),上调的有43种,下调的有141种。2.在EAE发病前后和Vitamin D补充前后的大鼠脊髓内均发生表达变化显著的蛋白,即E/C和VE/E都有变化的蛋白发现有44种。3.生物信息学分析得到每种蛋白的功能和疾病相关性,相互间网络等信息。4.Western Blot实验验证Hsp27和Gal-3均在EAE急性期有增加(与对照组相比),而在补充VitaminD后有明显降低,即:E/C上调,VE/E 调。这与iTRAQ结果相一致。结论:本研究首次将定量蛋白质组学iTRAQ技术应用于研究EAE诱导前后以及Vitamin D补充前后的EAE大鼠脊髓中的差异表达蛋白的筛选。结果获得了既与EAE病程相关又可能受到Vitamin D调控的蛋白44种。这为系统研究Vitamin D预防和治疗EAE/MS的作用机制,提供了新的候选蛋白和新思路。