研究背景结肠癌是当今世界上常见的消化道恶性肿瘤之一,严重威胁着人民群众的生命安全。因此寻找到高效的,低不良反应的,作用明确的治疗药物以及联合用药治疗方式亟待广大科研工作者研究和解决。羧胺三唑（Carboxyamidotriazole,CAI）是一个主要由美国国家癌症中心研究的非细胞毒类抗肿瘤新药,现已证实其具有抗肿瘤特性,抑制血管生成作用。然而,CAI在Ⅲ期临床试验中抗肿瘤作用表现温和,且使得吲哚胺2,3-双加氧酶1（Indoleamine 2,3-dioxygenase-1,IDO1）的表达升高,抑制免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀伤能力。为了增强其治疗效果并克服CAI引起免疫抑制这一缺点,我们试图找到与之合用能增强其抗肿瘤作用效果的药物。硝呋齐特（Nifuroxazide,NFX）是一种口服的硝基呋喃类抗生素,目前主要被用于预防和治疗细菌性痢疾、肠炎。研究发现硝呋齐特是信号转导与转录活化因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription3,STAT3）的有效抑制剂且具有潜在的抗肿瘤作用,已有学者报道了它对肝癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤的抗肿瘤细胞增殖及转移的效果。由于STAT3的活化伴随着IDO1表达的上调,因此推断两药合用有可能从免疫角度增强抗肿瘤疗效。本研究旨在评估两药合用是否具有协同抗肿瘤作用,并探讨其可能的机制,同时进一步深入探讨了CAI对体外激活的CD8⁺T细胞的影响。研究方法CCK8法检测CAI和/或NFX在两株结肠癌细胞株中的增殖抑制作用,并计算联合用药指数;caspase 3酶活检测试剂盒和流式细胞术检测细胞凋亡;DCFH-DA对细胞内活性氧进行染色并进行定量分析;细胞划痕实验检测药物对细胞迁移的影响;RT-qPCR检测MMP-2、MMP-9的表达;建立荷瘤小鼠模型,并评价CAI与NFX在体内抑制肿瘤的作用;H&E染色法检测肿瘤组织坏死情况。剥离荷瘤小鼠肿瘤组织,荧光定量PCR和western blot分别用于检测IDO1的mRNA和蛋白表达水平差异;WB检测STAT3、pSTAT3蛋白表达差异;流式细胞术检测C-C型趋化因子受体5[chemokine（C-C motif）receptor 5,CCR5]和C-C型趋化因子配体5[chemokine（C-C motif）ligand 5,CCL5]的表达差异。分离荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞,流式细胞术检测CD4⁺和CD8⁺T细胞比例。用免疫磁珠分选出小鼠CD8⁺T细胞,并进行激活,分为对照组、CAI组、ZK756326(Ca²⁺激活剂)组以及CAI+ZK756326组。流式细胞术检测细胞内游离钙离子水平;酶联免疫吸附检测细胞内钙调磷酸酶（calcineurin,CaN）的表达;免疫荧光染色检测细胞活化T细胞核因子2（nuclear factor of activated T cell 2,NFAT2）核转运;染色质免疫共沉淀-qPCR检测细胞中NFAT2调控细胞程序性死亡因子（programmed death 1,PD-1）表达。分离小鼠脾脏细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）,流式细胞术检测其中CD8⁺T细胞PD-1的表达。研究结果1.在结肠癌细胞株C26和HCT116中,CAI与NFX均表现出抑制作用,且抑制作用存在时间和剂量的依赖效应（P<0.01）。2.CAI与NFX合用在单药使用浓度5-10μM之间,CI<1,具有协同作用。3.CAI与NFX合用可显著升高细胞凋亡水平和caspase 3活性（P<0.01）。4.CAI与NFX合用可大大升高细胞内ROS水平（P<0.0001）。5.CAI与NFX合用可抑制细胞迁移,降低MMP2、MMP9表达水平（P<0.05）。6.CAI与NFX合用可以抑制荷瘤小鼠肿瘤体积生长,减轻瘤重,延长荷瘤小鼠生存期（P<0.05）。7.CAI与NFX合用可以诱导小鼠肿瘤组织坏死。8.药物合用组相比于CAI单药组,IDO1、P-STAT3的蛋白表达降低（P<0.001）。9.CAI与NFX合用升高荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞中CD4⁺和CD8⁺T细胞的比例（P<0.01）。10.CAI与NFX合用降低荷瘤小鼠小鼠肿瘤细胞CCL5、CCR5的表达（P<0.01）。11.CAI组显著降低CD8⁺T细胞内Ca²⁺浓度（P<0.001）,CAI+ZK756326组胞内Ca²⁺浓度有所升高（P<0.01）。CAI显著降低CD8⁺T细胞中钙调磷酸酶的含量（P<0.001）12.CAI可显著抑制NFAT2核转运（P<0.001）。13.CAI使NFAT2依赖的PD-1转录进程显著降低（P<0.001）。14.CAI使小鼠脾脏CTLs细胞中PD-1⁺CD8⁺T细胞比例显著减少（P<0.001）。研究结论CAI与NFX合用在体内外实验中对结肠癌均表现良好的药物协同抑瘤作用,其可能的抑制是NFX通过STAT3/IDO1信号调控通路抑制了由CAI引起的IDO1的表达升高,升高免疫器官中CD4⁺和CD8⁺T细胞的浸润,抑制肿瘤组织CCL5/CCR5信号轴,从而激活机体免疫系统对肿瘤的杀伤作用。此外,在体外人为激活的T细胞中,CAI可通过抑制CD8⁺T细胞内钙离子水平以及钙调磷酸酶的表达抑制NFAT2核转运,从而降低CD8⁺T细胞PD-1的表达,进一步产生免疫治疗干预作用。提示CAI可通过药物药物联用等方式进一步加强其临床抗肿瘤效果。