研究背景及研究目的:随着生命科学的发展,医学的进步,我国人民生活水平显著提高,威胁人类健康的传染性疾病得到了有效控制。然而随着寿命的延长和生存环境的影响等,肿瘤已成为威胁我国人民健康和生命的重要因素。基因组的不稳定性造成了肿瘤细胞的高度变异性,使其难于防治。据估算我国每年用于肿瘤诊治的花费高达千亿元,给社会和家庭带来沉重负担。发现新的药物靶点,对肿瘤的治疗具有重要意义。泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白质特异性降解的主要途径,参与细胞内多种过程,如基因转录、细胞周期调节、免疫反应、肿瘤的发生以及炎症的过程等。去泛素化酶使得泛素化修饰成为可逆的过程,确保了细胞中生命活动的动态平衡。近年来,随着人们对泛素-蛋白酶体系统在肿瘤发生、发展中扮演角色的深入研究,泛素-蛋白酶体系统已成为一种新的肿瘤治疗靶点。CRISPR/Cas9基因编辑技术是近几年兴起的第三代人工核酸内切酶系统。该系统由规律成簇间隔回文重复序列以及其相关蛋白9所组成,与之前的第一代锌指核酸酶(ZFN)和第二代类转录因子激活效应物人工核酸酶(TALEN)相比具有构建方法简单快捷、突变效率高、成本低廉、适用范围广等优势,已经成为科学研究中的一个重要工具,促进了许多研究结果的产生。本研究基于实验室前期乳腺癌肿瘤细胞生长泛素-蛋白酶体系统必需基因文库筛选实验结果,选择感兴趣的OTUD5基因,主要开展两方面的研究内容。在第一部分研究中,选择乳腺癌、人结肠癌、人正常肝细胞等多株细胞系探讨OTUD5是否为肿瘤细胞或某些种类肿瘤细胞生长的必需基因。在第二部分中,以BioID技术筛选OTUD5相互作用蛋白,深入研究OTUD5调控肿瘤细胞增殖的分子机制,为开发OTUD5靶向药物奠定基础。研究内容:(1)在三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系中验证OTUD5是否为乳腺癌细胞增殖需要基因;(2)在人子宫颈癌、结肠癌、正常肝细胞以及多株乳腺癌细胞系中深入研究OTUD5是否是调节乳腺癌或某些肿瘤细胞增殖的特异性需要基因;(3)利用BioID技术筛选OTUD5相互作用蛋白,深入研究OTUD5调控肿瘤细胞增殖的分子机制。研究方法:(1)OTUD5基因敲低:首先,建立目的基因OTUD5的gRNA稳定表达的MDA-MB-231细胞系,在细胞稳系中加入Cas9-GFP的腺病毒。每隔24小时用荧光显微镜观察细胞中荧光表达情况并记录,96h后检测OTUD5蛋白表达水平敲低状况。其次,建立CRISPR/Cas9一体化慢病毒系统,设计多个靶向OTUD5的gRNA,构建一体化慢病毒载体,包装慢病毒,筛选稳定表达的细胞,96小时后检测OTUD5的表达情况。同时,构建包装OTUD5-shRNA慢病毒,比较CRISPR和shRNA两种技术敲低OTUD5蛋白表达的效率。(2)OTUD5基因敲低效率检测:CRISPR/Cas9基因编辑系统对OTUD5基因敲低检测的方法分为两种,一是利用Cas9编辑基因的特点,经过PCR扩增gRNA上下游共计大概800bp左右的区域,而后经过退火重新形成含有T7E1核酸内切酶能够识别并剪切的区域,通过鉴定剪切效率来确定目的基因的敲低状况;二是利用蛋白免疫印迹法对目的蛋白的表达水平进行检测,确定基因编辑之后目的蛋白的表达水平被抑制。shRNA对目的蛋白的敲低利用蛋白免疫印迹法对目的蛋白的表达水平进行检测,确定敲低效率。(3)肿瘤细胞增殖检测:对于细胞增殖检测方法主要有两种,一种是基于内盐法(MTS)通过酶标仪检测吸光度来确定细胞增殖变化,在活细胞内MTS与偶联剂PMS相互作用,导致线粒体中的多种脱氢酶发生氧化还原反应,形成水溶性的有色甲瓒产物,其颜色与活细胞数量存在高度相关性。另一种方法是细胞的克隆形成实验,通过单个细胞在相同时间里细胞增殖所形成的细胞克隆斑的大小和数目来判断细胞生长效率。此外利用流式细胞技术检测细胞周期和凋亡是否存在变化。用PH3染色后流式细胞技术检测M期是否变化。用SA-β-gal检测细胞衰老,确定细胞的增殖变化是否由细胞衰老造成。(4)OTUD5调控肿瘤细胞增殖分子机制研究:利用Bio ID技术寻找与其相互作用蛋白,并利用IP验证筛选到的相互作用蛋白是否存在直接相互作用,找到敲低OTUD5引起细胞增殖抑制的原因。研究结果:(1)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术可以有效敲低MDA-MB-231中OTUD5基因的表达。OTUD5蛋白表达水平下降后,显著抑制了MDA-MB-231细胞增殖速率。为避免实验结果是由于脱靶效应引起,我们在不同的sgRNA和shRAN进行验证,且均证明了OTUD5是MDA-MB-231细胞增殖的必需基因。(2)OTUD5具有广谱抑制细胞增殖的作用,在所检测的人子宫颈癌、结肠癌、正常肝细胞以及多株乳腺癌细胞系中,利用CRISPR技术敲低OTUD5均能显著抑制细胞增殖(3)OTUD5敲低后,经流式分析,细胞表现为G2/M期周期阻滞;PH3检测结果显示M期有明显的增加,SA-β-gal检测衰老细胞比例无明显变化。(4)BioID实验揭示与OTUD5相互作用的蛋白主要参与细胞内RNA剪接和DNA损伤修复生物学途径。从中选取感兴趣蛋白进行分析验证,细胞全蛋白裂解液WB实验未检测到这些蛋白表达水平受OTUD5表达水平调控;Co-IP实验未检测到这些蛋白与OTUD5存在相互作用。研究结论:(1)CRISPR/Cas9基因编辑系统是科学研究中有效且简便可靠的方法,能够准确且快速的完成对目的基因的编辑。(2)经验证敲低OTUD5能够抑制肿瘤细胞增殖,但不引起肿瘤细胞凋亡和衰老。(3)Bio ID能够筛选到与目的蛋白存在潜在相互作用的蛋白。这些蛋白会为进一步的研究提供一定的方向性。