论文部分内容阅读
研究目的:探索mi R-154是否在胶质瘤中存在表达功能异常,随后将其在细胞学水平进行验证并给予适当干预,观察胶质瘤细胞的细胞参数变化,并明确miR-154在胶质瘤中的生物学作用。资料和方法:本研究选取88名已经手术后病理明确的颅内胶质瘤患者,其中53例为高级别胶质瘤（WHO III&IV）、35例为低级别胶质瘤（WHO I&II）;对照组的正常脑组织标本来源于23名重症颅脑外伤患者。两组患者间性别构成、平均年龄比较差异均无统计学意义（P>0.05）,具有可比性。通过蛋白印迹实验、qPCR,检测正常脑组织、低级别胶质瘤和高级别胶质瘤中miR-154基因的丢失水平及miR-154的表达水平,应用统计学方法进行对比分析,比较三组之间差异。之后我们比较胶质瘤细胞系U-138MG经过miR-154处理后,其对于替莫唑胺（Temozolomide）治疗的敏感度测试;将U-138MG分为三组,分别为空白对照组（仅加入生理盐水）、阴性组（加入mi R-154 precursor）和实验组（加入miR-154 mimic）,采用了一系列反应胶质瘤细胞生长活性的试验用来比较miR-154处理前后的胶质瘤细胞的生物活性变化,应用统计学方法进行对比分析。结果:首先我们的研究发现,miR-154在临床胶质瘤患者手术标本中的表达较正常脑组织显著降低（P<0.05）,其中较低级别（WHO I&II级）和高级别胶质瘤（WHO III&IV级）分别较正常脑组织降低了52.4%（P<0.05）和79.9%（P<0.01）。在胶质瘤组织间的比较发现,高级别胶质瘤中的miR-154表达水平显著低于低级别胶质瘤,两者之间存在显著性差异（P<0.05）。然而,在对低级别和高级别胶质瘤染色体检测中发现,两组病患之间miR-154基因丢失的比例分别为82.5%和92.7%,并未见明显差别（P>0.05）。于是,我们对miR-154基因转录起始部附近（-14到0 bp）进行了碱基甲基化的检测。发现高级别胶质瘤中基因转录起始部的碱基甲基化水平高达40+21.9%,而低级别胶质瘤的碱基甲基化水平仅为22.2+24.8%（P<0.05）。随后,我们对胶质瘤患者在肿瘤组织中的经典靶点CCND2和TLR-2的相互作用情况做了一系列的检测。首先,我们采用qPCR的方法对胶质瘤细胞系U-138MG中CCND2和TLR-2的表达情况进行评判:当miR-154mimic的有效浓度分别为74.89+77.25 pM和22,147+86.534 pM时,其于CCND2和TLR-2的mRNA抑制率为50%(IC50),两者之间存在显著统计学差异（P<0.01）。此外统计学研究发现,当miR-154的有效浓度分别为100pM时,其对于CCND2和TLR-2的mRNA出现显著抑制（P<0.01）。基于正常脑组织内的miR-154表达浓度,采用100 pM浓度的miR-154对U-138MG细胞系进行了处理后发现,CCND2和TLR-2的蛋白表达分别较阴性对照组降低了53.7%（P<0.01）和0.9%（P<0.05）。随后,我们采用了一系列反映胶质瘤细胞生长活性的试验用来比较miR-154处理前后的胶质瘤细胞的不同。我们首先观察了U-138MG细胞系对于替莫唑胺（Temozolomide）治疗的敏感度变化:miR-154转染的实验组细胞对于替莫唑胺的敏感度出现显著提升,其药物的半数致死浓度LC50由空白对照组472.8uM降低至209.6uM（P<0.01）。其次,我们对于转染前后U-138MG的生长速度进行了比较:在细胞划痕实验中,miR-154转染的实验组虽然在第2天与空白组之间比较无显著差异（D2:P>0.05）,但其在第5天和第14天的生长速度较空白对照组呈现了显著的下降（D5:P<0.05,D14:P<0.01）。随后,我们再次对miR-154转染的实验组细胞的转移迁移能力进行了比较:我们发现,miR-154转染的实验组的转移迁移能力为188+16 cell/mm2,显著低于空白对照组的225+28 cell/mm2（P<0.05）。最后,我们还比较了两组之间肿瘤细胞内生长（EGFRvlll）和凋亡（p53）相关蛋白的表达情况:发现在miR-154转染的实验组中,U-138MG细胞EGFRvlll和p53相对表达量分别为对照组的70%+7%（P<0.05）和160%+13%（P<0.05）。结论:研究最后发现:1)miR-154的表达高低与胶质瘤的病理级别之间存在密切关系,这主要是由于2)胶质瘤中miR-154表达水平显著降低,其主要原因是miR-154基因的丢失和miR-154基因转录起始部过度的甲基化。3)当给予补充miR-154后,胶质瘤细胞的恶性程度受到显著抑制。结果提示,作为一种抑癌基因,miR-154在胶质瘤中具有肿瘤抑制作用,所以miR-154可能作为有效的新型胶质瘤靶向治疗靶点,从而可能为未来胶质瘤的治疗提供更为丰富的选择。