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【目的】本研究通过培养大鼠原代肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)并进行不同时间低氧处理,观察低氧对大鼠原代PASMCs增殖、细胞内[Ca2+]i的影响,以及在不同低氧时间处理下,低氧诱导促有丝分裂因子(HIMF)的表达情况,探讨HIMF对大鼠原代PASMCs增殖的作用及机制。【方法】(1)大鼠原代肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的提取、培养及鉴定:利用相关显微器械(显微剪和显微镊)在体式显微镜下仔细分离出大鼠远端肺动脉,运用酶消化方法消化、分离出原代PASMCs并进行培养;在光镜下观察细胞形态,通过平滑肌细胞α肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)以及八因子(FactorⅧ)特征性免疫荧光标记染色来鉴定细胞的纯度。(2)观察慢性低氧对大鼠原代PASMCs增殖的影响:选取生长状态良好的第2-3代细胞,将其分为不同低氧时间处理组(H24h、H48h、H60h、H72h),置于37℃,4%O2、5%CO2、91%N2的三气培养箱中,低氧下暴露不同时间(24h,48h,60h,72h),并设置常氧对照组,分别采用CCK-8、细胞计数以及Edu法观察不同时间低氧对大鼠原代PASMCs增殖的影响。(3)检测不同时间低氧对大鼠原代PASMCs中HIMF表达的影响:采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative PCR,Q-PCR)、蛋白免疫印迹(western-blot)方法观察不同时间低氧对大鼠原代PASMCs中HIMF mRNA和蛋白质表达的影响。(4)大鼠原代PASMCs内[Ca2+]i浓度测定:将原代提取的大鼠PASMCs接种到六孔板盖玻片上,置于37℃,4%O2、5%CO2、91%N2的三气培养箱中,予以上述细胞增殖最强的时间点进行低氧处理,并设置常氧对照组,随后采用细胞动态荧光成像系统检测其对大鼠原代PASMCs内[Ca2+]i浓度的影响。(5)特异性siRNA沉默大鼠原代PASMCs中HIMF的表达,再予以常氧和上述最佳低氧时间处理,观察其对大鼠原代PASMCs内[Ca2+]i浓度的影响。(6)构建HIMF过表达慢病毒载体,以HIMF慢病毒转染大鼠原代PASMCs,再予以常氧和最佳低氧时间处理,观察其对大鼠原代PASMCs内[Ca2+]i浓度的影响。【结果】1、利用酶消化方法成功分离出大鼠原代PASMCs,光镜下观察细胞形态呈长梭形,免疫荧光鉴定提示:α-SMA荧光染色呈阳性反应,而Vimentin以及FactorⅧ染色结果均为阴性,细胞纯度达98%以上。2、常氧对照组和慢性低氧(4%O2、5%CO2、91%N2)组大鼠原代PASMCs增殖活力都随着培养时间的延长而增加,低氧60h时大鼠原代PASMCs增殖活力达到高峰与常氧对照组相比较具有显著性差异。3、各常氧对照组大鼠原代PASMCs中HIMF mRNA和蛋白质均呈低水平表达,低氧能够诱导大鼠PASMCs中HIMF mRNA和蛋白质表达增加,并呈时间依赖性,H48h、H60h、H72h组相对于各常氧组HIMF mRNA和蛋白质的表达明显增加。4、慢性低氧(60h,4%O2)条件下,大鼠原代PASMCs中储量操纵性钙内流(SOCE)水平较常氧对照组(N60h)比较显著升高。5、特异性siRNA沉默大鼠原代PASMCs中HIMF基因的表达后,再予以慢性低氧(4%O2、5%CO2、91%N2)处理60h,相对于慢性低氧组(H60h),PASMCs内SOCE水平明显降低;沉默HIMF基因后予以常氧处理60h,相对于正常对照组(N60h)PASMCs内SOCE水平无明显改变。6、慢病毒过表达大鼠原代PASMCs中HIMF基因后,再予以常氧处理60h,相对于常氧对照组(N60h)PASMCs内SOCE水平明显升高;过表达HIMF基因后予以慢性低氧(4%O2、5%CO2、91%N2)处理60h,相对于慢性低氧对照组(H60h)PASMCs内SOCE水平无明显改变。【结论】1、低氧能够上调大鼠原代PASMCs中HIMF的表达、促进PASMCs的增殖;2、低氧能够增加大鼠原代PASMCs中储量操纵性钙内流(SOCE)水平;3、HIMF在低氧诱导的大鼠原代PASMCs SOCE水平增加的过程中可能具有重要作用。