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目的：自1983年Marshall et al 首先从胃粘膜分离出幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）以来，大量研究表明此菌与慢性胃炎、消化性溃疡存在密切相关，并被WHO列为一级致癌因子。人群中Hp的感染率高达50%，但由于临床抗生素滥用和耐药菌株的日益增多，目前抗Hp感染重点已转向免疫预防和治疗。由于牛乳可以增加IgG的稳定性，且其应用安全、广泛，因此应用含特异性抗Hp抗体的免疫乳防治Hp感染，可能是口服抗体应用于免疫防治的新思路。本研究从体内和体外（整体和细胞）等不同水平探讨牛抗Hp抗体对Hp的生长增殖及其定居能力的影响及其初步机制。方法：1 SS1、NCTC11637菌株的培养和抗原制备：SS1及NCTC11637采用血平板传代扩增。气体条件：85%N2、10%CO2、5%H2，37℃培养2-3天。革蓝氏染色行形态学鉴定，尿素酶、触酶试验等生物学性状鉴定，生理盐水收集并洗涤3次，反复冻融，超声粉碎后测Pr，低温保存备用。2 牛抗Hp抗体的制备、分离、纯化及鉴定：Hp超声全菌抗原接种奶牛，按多克隆抗体制备常规，腋下皮下接种，全程免疫后每1~2月加强一次，琼脂双向扩散至1:32<WP=5>时可采集牛血制备抗血清，同期收集牛常乳。抗血清及牛乳低温保存备用。经50%、33%、33%饱和硫酸铵粗提后沉淀用生理盐水溶后对生理盐水透析24小时，上DEAE-32柱，收集高峰蛋白，经SDS-PAGE鉴定后分装，-20℃保存备用。3 Hp抗原的SDS-PAGE电泳及牛抗Hp抗体的免疫印迹分析：Hp超声上清(Pr 1.06mg/ml),按常规SDS-PAGE电泳：分离胶12%、成层胶5%、上样量20μl（样本处理液稀释后）。电转移条件1.6mA/cm2，转移1.5小时，转移完毕NC膜置5%脱脂奶粉封闭过夜，加一抗/HRP-二抗，室温振摇4小时， DAB显色5-10分，蒸馏水终止显色。4 牛抗Hp IgG对SS1及NCTC11637抑制Hela 细胞生长增殖功能的中和作用：通过Hela生长曲线确定Hela细胞的接种密度。建立SS1及NCTC11637对Hela 细胞生长增殖功能的抑制作用的MTT分析方法，以牛抗Hp IgG分别与SS1及NCTC11637共育2小时后各自的抑Hela增殖功能的抑制率变化来评价牛抗Hp-IgG对SS1及NCTC11637菌体蛋白的中和作用。5 牛IgG对Hp致 BALB/c小鼠感染模型的防治研究：a、造模：取SS1 48小时新鲜培养物以布氏肉汤稀释为109CFU/ml，BALB/c小鼠禁食16小时后先以5%NaHCO3 0.2ml灌胃， 5分后以SS1 0.4ml /只灌胃，共108只，2小时内完成，隔天1次共5次；b、BALB/c小鼠Hp感染率检测：分别于接种后4周、6周、8周处死若干动物，作如下处理：I摘眼球取血 II取胃组织后，沿胃大弯剪开，生理盐水冲洗后，取一半胃组织作分浆，<WP=6>分浆次数4~6下，匀浆浓度20%，接种至选择性培养基（Vancomycin 4.0mg Polymyxin 100μg Trimethoprim 2.0mg/100ml培养基，脱纤维羊血10%）。划线法分离培养3-5天，气体及温度条件同1. III取另一半胃组织的纵向1/2作涂片及Urease；1/2作病理切片,应包括食管末端贲门、胃体、胃窦和部分十二指肠，分别作HE染色和Warthin-Starry银染。HE染色主要用以观察胃组织病理变化。Warthin-Starry银染主要作Hp鉴定。C、防治试验分组及干预措施：自接种后4周确定Hp定植后即开始治疗实验（括号内为干预措施给予时间），设标准三联治疗对照组（2周）、正常牛乳对照组（6周）、免疫乳治疗组（6周）、纯化IgG治疗组（6周）、模型对照组。预防实验自造模开始即予免疫乳和正常牛乳（对照）共10周。标准治疗结束后4周，处死全部动物，作病理切片、分离培养、尿素酶试验及组织涂片。D、取血清和胃组织匀浆测鼠IgG和抗Hp IgG：以Hp 超声全菌包被检测板，包被浓度10ug /ml,用辣根过氧化物酶标记（HRP-）羊抗小鼠IgG建立间接ELISA检测小鼠特异性IgG；以羊抗小鼠IgG包被检测板，包被浓度10ug /ml,用HRP-羊抗小鼠IgG建立夹心ELISA检测小鼠总IgG。结果：1 Hp抗原的SDS-PAGE及牛抗Hp抗体的免疫印迹：Hp超声后蛋白经SDS-PAGE分离后可分辩条带有13条，主要染色条带为66KD、54KD、45KD、30KD、27KD；牛抗Hp抗体的免疫印迹图谱显示8条免疫反应条带，低分子量（<32 KD）条带染色清晰，较高分子量（>45 KD）<WP=7>染色较浅。2 牛抗Hp抗体中和SS1及NCTC11637的细胞毒作用：细胞毒模型发现SS1与NCTC11637均能抑制Hela细胞增殖，但对于相同的细胞毒效应SS1所需浓度高于NCTC11637；中和模型发现牛IgG可分别中和SS1及NCTC11637的细胞毒作用，且具有剂量-反应关系。3 牛抗Hp抗体防治BALB/c小鼠感染Hp的作用：在不同的干预措施下小鼠的Hp感染率不同：模型组80%（12/15）、标准三联组0（0/12）、正常牛乳治疗对照组63.64%（7/11）、纯化IgG治疗组36.36%（4/11）、免疫乳治疗组33.36%（3/9）、正常乳预防对照组44.44%（4/9）、免疫乳预防组25%（3/12），统计学分析表明免疫乳和抗体治疗组与免疫乳预防组同模型组Hp感染率均有显著差异，正常乳治疗和预防组与之无显著差异。在不同处理小鼠胃组织病理改变方面，模型组小鼠可观察到上皮下组织细胞、嗜酸性粒细胞浸润，壁细胞减少，粘膜层有淋巴细胞浸润但炎症程度均较轻，另见腺体囊性扩张、腺体萎缩（灶性）各一例；免疫乳（抗体）预防/治疗?