研究背景须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)是一种亲角质的致病真菌,可以感染人和动物,并互相传播。须癣毛癣菌分泌多种蛋白酶来分解表皮组织,同时为其在角质上的生长和增殖获取营养物质。此外,分泌的角蛋白酶还可引发宿主的细胞和体液介导的免疫反应。一个编码丝氨酸蛋白酶的、由7个基因所组成的基因家族--枯草杆菌蛋白酶基因家族(SUBs)已经在须癣毛癣菌中被分离出来。其中SUB6基因相关的毛癣菌素蛋白Tri r2,可以同时引发宿主的速发型和迟发型超敏反应,而SUB6基因与其在体内外分泌的调控作用尚未可知。对于研究一个潜在的毒力基因最简便有效的方法就是通过定点基因敲除后分析突变株表型和致病性的变化,即反向遗传学的方法。目前,根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)是最常应用于真菌基因敲除的方法,其已经成功的应用于多种丝状真菌的遗传转化。目的通过ATMT法将须癣毛癣菌SUB6基因敲除后,对突变株的表型、生长速率、角蛋白酶活性、角蛋白酶基因表达及对动物机体的致病性变化进行分析,以研究该基因的功能。方法构建含有SUB6基因同源片段及潮霉素抗性标记基因的双元载体pDHt/SUB6-ⅠⅡ::hph,将其转化进入根癌农杆菌后,在一定的条件下与须癣毛癣菌分生孢子共培养实现基因敲除的目的,并通过PCR和Southern blot的方法对得到的转化子进行鉴定。观察突变株表型、生长速率,测定体外角蛋白酶活性,并通过实时荧光定量PCR的方法对角蛋白酶相关基因的转录水平进行检测。通过将突变株接种实验动物,观察其引发的临床及病理变化,并使用ELISA的方法测定接种动物脾匀浆中特异性免疫相关的细胞因子水平。结果通过PCR以及Southern blot的验证,确认须癣毛癣菌SUB6基因被潮霉素抗性标记基因通过同源重组方式定点敲除。与须癣毛癣菌标准株相比,SUB6基因突变株的金属蛋白酶基因(MEP)4和SUB3基因表达量显著升高,体外角蛋白酶活性显著增强；而被SUB6基因突变株感染的实验动物则表现为较轻程度的临床症状和病理变化,其免疫抑制因子IL-10在突变株感染后表现为持续高水平的分泌,而与迟发型超敏反应相关的细胞因子IFN-γ, TNF-α和IL-12分泌水平的升高则表现为出现相对较晚,且增幅较低。结论须癣毛癣菌SUB6基因可以通过ATMT体系进行敲除,成功获得可以稳定遗传的单拷贝、同源重组的SUB6基因缺失菌株：须癣毛癣菌SUB6基因功能与引发机体免疫反应相关,其突变株所引发动物机体的免疫反应发病时间较晚,病变程度较弱,致病性降低；须癣毛癣菌角蛋自酶相关基因的联动调控作用使得SUB6基因缺失株的体外角蛋白酶活性增加,且该突变菌株并未完全失去致病性。