循环肿瘤细胞是肿瘤转移复发的关键,肿瘤的早期发现和早期诊断有助于患者及时接受有效治疗,从而降低病死率,改善患者预后。循环肿瘤细胞的检测作为一种实时"液体活检"手段为肿瘤疾病的诊断、评估预后生存、指导个体化治疗等提供重要价值。循环肿瘤细胞是外周血中的稀有细胞,对检测方法的敏感性和特异性要求极高。目前的循环肿瘤细胞检测方法均有检出率低、敏感性差、特异性不足、价格成本高等缺陷,鉴于循环肿瘤细胞的重要临床意义,寻找更好的检测方法显得十分迫切。近年来纳米基底法成为检测循环肿瘤细胞发展最为迅速的工具。本研究中我们采用腐蚀气体的新方法,通过反应离子刻蚀法(RIE)干法刻蚀硅硼玻璃,获得均匀的纳米结构的基底。特异性适配体已用于靶向药物递送,双特异性的适配体能否提高肿瘤细胞的分离效率尚不明确。抗EpCAM适配体(AEA)和抗前列腺特异膜抗原(PSMA)适配体(APA)为常用的适配体,实验以三种人前列腺癌细胞 LNCaP(EpCAM+/PSMA+)、PC3(EpCAM+/PSMA-)、Ramos(EpCAM-/PSMA-)为研究对象,通过在制备的纳米基底上加入AEA和APA适配体以期提高其对肿瘤细胞的分离捕获效率。目的通过干法刻蚀硅硼玻璃获得纳米结构的基底,联合肿瘤细胞的特异性适配体,建立一种新型的循环肿瘤细胞分离的方法。方法利用氧化物蚀刻机产生的C3F8和C4F8气体干性刻蚀硅硼玻璃,获得大小均匀的具有纳米结构的基底并通过原子力显微镜对其进行表征鉴定;计数一定数量的4肿瘤细胞(PC3、MCF-7、HepG2、SW620),用培养液混匀后加入到制备成功的纳米基底上,计算细胞贴附率;DNA模板滚环复制制备APA和AEA适配体并采用凝胶电泳验证;化学反应法将APA和AEA适配体固定到纳米基底;将Cy3标记的AEA,APA和对照DNA,分别直接和3种前列腺癌细胞孵育,通过Cy3的荧光强度来计算适配体与细胞的结合水平;纳米基底捕获肿瘤细胞实验分为4组:AEA+细胞组,APA+细胞组,AEA/APA+细胞组,以及对照DNA+细胞组,培养LNCaP、PC3、Ramos三种前列腺细胞,分别加入以上四组,DAPI.染色后,使用高内涵筛选系统的显微镜计数计算纳米基底对三种细胞的捕获水平;将AEA和APA二种适配体混合后进行凝胶电泳检测适配体之间有无二聚体的产生;采用AEA化的纳米基底捕获模拟肿瘤患者外周血实验,检测三种高表达EpCam的肿瘤细胞(人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF7细胞以及人肠癌细胞SW620细胞),在高内涵筛选系统高通量显微镜下全片观察计数异常细胞,计算检出率。CTCs判定标准:细胞呈圆形、椭圆形或长椭圆形,边缘清楚完整;免疫荧光染色阳性细胞呈CK18+/DAPI+/CD45-。结果原子力显微镜显示我们成功的制备了直径大小在126.8nm-412.9nm之间的纳米基底,其中5min、100伏条件下制备的纳米基底直径374.3nm为最佳适宜捕获肿瘤细胞的直径;纳米基底对4种肿瘤细胞的半小时贴附率均在93%以上;凝胶电泳结果显示经过30min滚环复制(RCA)反应我们成功扩增出APA和AEA适配体;适配体与3种肿瘤细胞结合实验显示LNCaP细胞荧光强度最高,其中AEA适配体结合的荧光强度高于APA适配体,PC3细胞只检测到AEA组的荧光信号,作为对照的Ramos细胞和DNA与适配体共孵育后均未检测到明显的荧光信号;细胞捕获实验结果显示结合AEA和APA适配体的纳米基底对LNCaP细胞的捕获率分别为85%±5.3%和68%±7.5%,结合AEA适配体的纳米基底对PC3细胞的捕获率分别为76.2%±8.5%,APA组捕获率仅为1.2%±0.4%;对照组连接AEA或APA的纳米基底对Ramos细胞捕获水平均低于2%;连接有双适配体AEA/APA的纳米基底对LNCaP和PC3细胞的捕获率为8.7%±2.3%和4.5%±1.8%;进一步使用了不同比例混合的AEA/APA(1:3,1:1和3:1)来检测对PC3细胞的捕获水平,结果显示PC3细胞捕获率分别为0.5%、6.7%和42.1%;凝胶电泳结果显示在约120-nt的位置出现新的弱条带;模拟肿瘤患者外周血实验表明,连接AEA适配的纳米基底对MCF7、HepG2、SW620三组细胞的检出率分别为:84%±5.78%、73.6%±5.41%、70%±6.28%,三种细胞的平均检出率为75.87%。结论采用腐蚀性气体干法蚀刻硼硅玻璃可以快速可靠的制备纳米结构直径均一性良好、面积较大的纳米基底,通过对反应条件的改变可将纳米基底的直径控制在126.8nm-412.9nm之间,其中370nm与细胞基质的大小一致,是最佳适宜捕获肿瘤细胞的直径。特异性适配体与纳米基底连接后,单适配体能够提高纳米基底对肿瘤细胞的捕获水平,但双特异性适配体则导致细胞捕获水平明显下降,原因可能是由于适配体之间形成了异二聚体影响了对细胞的捕获;模拟肿瘤患者外周血实验证实纳米基底结合特异性的单适配体对循环肿瘤细胞具有高检出率。适配体之间形成的异二聚体可能会削弱多种特异性适配体在检测和分子的分离中应用,这提示在多适配体的应用过程种需要通过一定的方法进行严格的排除异二聚体的产生。该方法制备的玻璃纳米基底具备高效、可靠、面积大(约80ccm2)的优势。纳米基底的快速制备及表面包被处理,绕过CTCs分离环节,利用纳米基底捕获CTCs后直接进行检测,避免了分离过程中的CTC损耗。纳米基底的方法不仅能检测CTCs数量,还能够分析CTCs的肿瘤相关分子表达情况,应用于临床后将为肿瘤的诊断、疗效监控和预后判断提供更准确的信息。放射治疗是不可切除的原发性肝癌重要治疗手段之一,但放射性肝损伤及放射乏氧抗拒影响肝癌放疗效果。通过放射增敏的方法可以提高肝癌放疗的疗效。去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)主要表达于哺乳动物肝实质细胞表面,是介导细胞内吞的常用靶点。纳米金(GNPs)在多个体内外实验中被证实有良好的放射增敏效应,在前期体外实验中我们合成了携带ASPGR特异性配体--半乳糖(GAL)以及聚乙二醇(PEG)修饰的纳米金(GNPs)复合物GAL-PEG-GNPs,证实了 GAL-PEG-GNPs对ASGPR阳性肝癌细胞HepG2具有放射增敏效应并初步探讨其增敏机制,本研究通过建立ASGPR阳性肝癌裸鼠模型,在体内水平研究GAL-PEG-GNPs的靶向性、器官毒性、组织分布、放射增敏。目的建立ASGPR阳性肝癌裸鼠模型,研究GAL-PEG-GNPs在裸鼠体内的药物代谢、器官分布、放射增敏效果,为肝癌的放疗增敏提供理论依据。方法培养高表达ASGPR的HepG2细胞,建立Balb/c肝癌皮下移植瘤裸鼠模型;通过尾静脉途径将GNPs和GAL-PEG-GNPs注射到裸鼠体内,抽血裸鼠静脉血,ICP-MS 在不同时间点(5min、30min、1h、2h、3h、4h、8h、12h、24h、48h)检测纳米材料的药代动力学;处死裸鼠后分离心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织及肌肉,通过ICP-MS检测Au在不同时间点(30min、16h、24h)的脏器组织分布情况;模型建立后,将荷瘤裸鼠固定于特制的盒子里,对肿瘤局部采取6MeVX线照射(2.5Gy/次,每3天1次,共8次,总剂量为20Gy),通过裸鼠的体重、移植瘤的体积变化、最终瘤重来观察纳米材料的放射增敏性。结果裸鼠在接种HepG2细胞悬液后3-4天后在右前腋下形成可测量的瘤块,从细胞接种后第5天测量肿瘤体积,第22天时所有肿瘤体积达到60mm3-340mm3。通过裸鼠尾静脉注射纳米材料后,二种纳米材料在血液代谢的半衰期分别为t1/2GNPs=1.007 h,t1/2GAL-PEG-GNPs=3.406 h;组织器官分布检测显示 GNPS 和GAL-PEG-GNPs注射到裸鼠体内后大部分都被肝脏和脾脏摄取,GAL-PEG-GNPs组在肿瘤组织内Au含量明显高于GNPs组,3个时间点差异均具有统计学意义。裸鼠放射增敏实验发现,单纯放射组肿瘤体积在治疗开始后增加速度明显大于注射联合放射的二组,至放疗结束时GAL-PEG-GNPs联合放疗组将肿瘤体积控制到最小,明显小于单纯射线组和GNPs联合放疗组的(p<0.05)。三组裸鼠体重在放疗开始后均稳步增长,GAL-PEG-GNPs联合放疗组裸鼠生长最好,体重最大,但较普通放射组及GNPs联合放疗组无明显差别(p>0.05)。治疗第22天GAL-PEG-GNPs联合放疗组的肿瘤体积抑制率为82.22%,而GNPs联合放疗组为47.24%,组间比较差距具有统计学意义(p<0.05)。结论本研究在体内水平证实了 GAL-PEG-GNPs具有针对ASGPR阳性肝癌裸鼠模型的靶向性和低毒性,GAL-PEG-GNPs较普通GNPs更能有效的提高肿瘤体积抑制率,改善放疗效果,实验结果为肝癌的放疗增敏及肝癌靶向性药物载体的应用提供了理论依据。