论文部分内容阅读
目的：肝癌发生发展是多因素、多步骤综合作用的结果，它是一个复杂的多基因疾病已成为共识。而作为目前生命科学研究热点的microRNA(miRNA)，由于其在肝癌发生中具有癌基因及抑癌基因的双重作用，亦受到广泛关注。既往研究表明，miR-145是一种潜在的肝癌“保护性”miRNA，本研究旨在探讨HepG2细胞中miR-145与肝癌干细胞之间的关系及可能的分子机制，以阐明miRNA调控细胞增殖的可能作用机制，揭示肝癌细胞生长的规律，为肝癌的治疗探索一条新的思路。方法：（1）按常规培养方法，体外培养HepG2细胞，选取处于对数生长期的细胞为实验细胞，接种于细胞培养板或培养瓶中，待细胞均贴壁完全后，弃去废弃培养液。（2）分别以siRNA-NC-FAM和shRNA-GFP为转染物，以脂质体Lipofectamine2000为转染试剂，倒置荧光显微镜下观察转染效率，进行转染效率评价。（3）本实验拟分为以下四组，分别为：miR-145模拟物转染组，模拟物阴性对照转染组，只加转染试剂的对照组以及不做任何处理的空白对照组，根据人源miR-145-5p的基因序列,设计并合成双链模拟物（miR-145-5p mimics）。将miR-145-5p mimics以脂质体Lipofectamine2000包裹，并转染至HepG2细胞株中。（4）实时定量PCR法检测miR-145-5p的表达水平。（5）转染后48小时，Western blot方法检测细胞内目标基因OCT4蛋白表达水平。（6）细胞增殖实验CCK-8法检测miR-145-5p对HepG2细胞株在不同时间段(24小时、48小时、72小时)生长的作用。（7）实时定量PCR检测干细胞标志物CD90mRNA表达的变化。结果：（1）用中剂量的siRNAoligo转染HepG2细胞效果较好；（2）与各实验对照组相比，miR-145-5p模拟物转染组的miR-145表达明显上调；（3）过表达miR-145抑制HepG2细胞生长；（4）转染后48小时模拟物转染组过表达的miR-145可明显降低OCT4蛋白水平及干细胞标志物CD90mRNA的表达。结论：miR-145可能通过下调OCT4基因表达抑制HepG2干细胞的增殖，是一种潜在的肝癌保护性miRNA。