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单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌),是一种分布广、耐受力强、致病力高的病原微生物,已被世界卫生组织(WHO)列为四大食源性致病菌之一。通常感染老、弱、病、残、孕等免疫力低下的人群,可引发败血症、脑膜炎、孕妇流产及新生儿死亡,死亡率高达30%。本研究根据上海市食品源与人源菌株的分布特征,阐明食品源、人源菌株在分子分型、遗传及表型特征的差异性,对单增李斯特氏菌的预防与控制、掌握遗传信息数据的传递和表达具有重要的意义。1、单增李斯特菌菌株血清型鉴定、分子分型及耐药性分析本研究收集整理2004~2013年上海市单增李斯特菌120株(食品源菌株107株,人源菌株13株),其中鸭肉源菌株数量最高,占25.00%,其次是鸡肉源和牛肉源菌株(分别占23.00%),人源菌株占10%。鸭肉、鸡肉、牛肉为李斯特氏菌病的重点防控食品类别。120株菌株分属三个血清组型:1/2a,3a(44株)、1/2b,3b,7(29株)、1/2c,3c(47株)。1/2a,3a(44株)、1/2b,3b,7(29株)分离株具有引起疾病爆发、零散发病的潜在危险。人源菌株中1/2c,3c血清组菌株的比例仅为7.69%,该血清型在人源和食品源分布数量上存在显著性差异,该差异与内化素inlA的无义突变相关。对120株单增李斯特菌进行了脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型,共产生74个PFGE型,14个不同的PFGE亚群(S1~S14),最大的亚群包含全部1/2c,3c菌株(47株),确定为上海市主要流行亚群。人源菌株SHL004,SHL005和SHL012分别与食品源菌株具有相同的PFGE型,确定上海市这三株克隆株已引起李斯特氏菌病的零散发生。基因组测序并与国外爆发菌株基因组序列比对,表明上海市单增李斯特菌具有种群迁移特征。14种抗生素的耐药分析表明:120株菌株中,7株表现为四环素耐药,13株头孢曲松耐药,其他12种抗生素均表现为敏感,耐药率为16.7%。头孢曲松为一线药物,不建议用于治疗单增李斯特菌感染。四环素耐药株均属于1/2a,3a血清型,携带tet(M)耐药基因与Tn916-Tn1545转座子序列,具有水平转移的潜在风险,此类菌株分布于多类食品,结合PFGE聚类特征可确定不同来源食品间存在交叉污染现象。2、单增李斯特菌菌株毒力因子与内化素基因inlA的序列特征本研究对12种重要毒力因子分布进行检测,其中hly、plcA、plcB、actA、inlA、inlB、inlI、prfA基因的菌株携带率均为100%,120株单增李斯特菌均具有潜在致病性。侵袭关键因子内化素InlA基因序列分析表明,120株菌中,inlA无义突变株共计51株,突变类型共有6个,具有地域性特征。无义突变株分属两个血清型组,1/2c,3c菌株44株,1/2a,3a菌株7株。食品源菌株中46.72%的菌株携带该类突变,人源菌株中仅7.69%的菌株携带该类突变,该类菌株在人源和食品源分布上存在差异,系统发育显示突变株inlA可以按照Lineage型和血清型进行聚类。3、单增李斯特菌菌株侵袭力分析及毒力因子转录水平检测挑选出的21株人源与食品源菌株均有菌膜形成能力与溶血特征。利用Caco-2、Raw267.4细胞模型、BALB/c动物模型进行了侵袭实验,发现1/2c菌株菌膜产量平均值较其他两个血清型菌株高,从而解释1/2c菌株食品源菌株分布广的现象;同时发现inlA无义突变株与非突变株对Caco-2的侵袭能力、在小鼠肝脏脾脏富集量具有显著性差异(p<0.01),通过SPSS相关性分析发现无义突变inlA的携带与侵袭力减弱之间存在相关性(Pearson’s coefficient 0.927,p<0.01),因此该突变引发了菌株突破肠道屏障侵袭力的降低。强侵袭力菌株(无突变株)和弱侵袭力菌株(inlA无义突变株)对Raw267.4具有相同的侵袭力,4 h胞内增殖数量无显著性差异(p>0.05),验证了单增李斯特菌对吞噬细胞具有强感染活力。21株基因组测序菌株在BHI和鸡肉中的毒力基因inlA、inlB、hly、bsh、prfA相对表达量进行QRT-PCR分析,结果表明,同一菌株中毒力因子相对表达量hly>bsh>inlB>inlA>prfA。毒力因子相对表达量与菌株携带无义突变inlA基因无相关性。InlA无义突变株仍然能够正常转录。5种毒力因子启动子序列分析结果显示功能区段碱基保守性强,确保毒力因子稳定表达。因此,inlA无义突变株仍具有潜在致病性。4、单增李斯特菌基因组测序与分析采用高通量测序技术(High-throughput sequencing)对挑选出的13株人源菌株和8株食品源菌株(7株属于inlA无义突变株)进行基因组测序,与21株GenBank公开基因组序列进行了比较基因组分析,提取出核心基因的SNPs位点进行了统计(153,382个),构建出系统发育树。该树具有两个主要分支,一个分支包含1/2a、1/2c型菌株,1/2a菌株基因组显示具有较高变异特征,1/2c菌株基因组保守聚类成簇,同时1/2c菌株中inlA的无义突变株能进行聚类,SNPs相差56~109个,基因组同源性高。分析可确定1/2c菌株是1/2a菌株进化过程中产生的一个分支。另一个主分支中1/2b菌株也保持较高的变异特征。同时MLST结果显示7株单增李斯特菌属于新的ST型,其余菌株分别属于ST 3、7、8、9、29、87、381、391、753。同时结合基因组序列,对117个毒力因子及相关代谢因子分布和LIPI-1、LIPI-2、LIPI-3的结构进行了分析,1/2a菌株毒力岛组成为:inlG、inlC2、inlD、inlE;1/2b菌株的排序为inlC2、inlD、inlE;1/2c菌株的排序为inlG、inlH、inlE。inlG为Lineage II所特有基因。LIPI-3仅存在1/2b部分菌株中。毒力岛分布和血清型具有相关性。