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木聚糖酶（1，4-β-D-xylanxylanohydrlase，EC3.2.1.8）通过内切方式水解木聚糖分子中的β-1，4-木糖苷键，水解产物以木二糖和木三糖为主，及少量的木糖和阿拉伯糖。以木二糖、木三糖为主的低聚木糖以其良好的低热性、稳定性、保湿性、双歧杆菌增殖作用等保健作用广泛应用于食品领域。目前，低聚木糖主要通过酶法降解木聚糖制备。筛选和制备高活性和高底物特异性的木聚糖酶组分，以获得二糖、三糖比例高，单糖比例低的水解产物是生产低聚木糖的技术关键。传统的方法是通过菌种筛选和发酵控制获得高木聚糖内切酶活性、低木糖苷酶活性的木聚糖酶，但是结果不够理想。采用基因工程手段表达木聚糖酶将是解决这一问题的有效手段。
本文以实验室前期构建的pPIC9-xyn2载体为基础，从启动子和信号肽的替换入手，构建新型的表达载体，为木聚糖酶在毕赤酵母中的安全高效分泌表达探讨新的方法，并对重组木聚糖酶的酶学性质、摇瓶发酵条件和酶解产物进行了研究，以期为重组木聚糖酶的应用提供参考。研究内容及结果如下：
1.构建新型表达载体以pPIC9-xyn2载体为基础，从启动子和信号肽的替换和改造入手，设计和构建了毕赤酵母表达载体pGAPHα-xyn2、pGAPRHα-xyn2、pGAPHINU-xyn2、pGAPHαM-xyn2、pGAPHαE-xyn2。在这一系列载体中，xyn2均由GAP启动子调控，引导外源蛋白分泌表达的信号肽分别为酿酒酵母的α-Factor信号肽、菊粉酶基因信号肽INU以及优化设计的α-Factor信号肽，在后两个载体中则加入了增强子。
2.木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达以毕赤酵母菌株GS115为受体菌，采用电击转化法分别将表达载体pGAPHα-xyn2、pGAPRHα-xyn2、pGAPHINU-xyn2、pGAPHαM-xyn2、pGAPHαE-xyn2转化毕赤酵母，获得毕赤酵母重组转化子。随机挑取转化子，于YPD培养基中振荡培养72h后，DNS法测定酶活，各重组菌株的酶活依次为92IU/ml、104IU/ml、85IU/ml、168IU/ml、128IU/ml。结果表明，GAP启动动子能够实现外源基因的表达，INU信号肽和改造后的α-Factor信号肽均能够引导外源蛋白的分泌，增强子能够起到增强GAP启动子的作用。SDS-PAGE分析表明，重组木聚糖酶的分子大小约为21Kda。
3.重组木聚糖酶酶学性质的研究将木聚糖酶分别置于不同的温度、pH、阳离子等条件下，研究木聚糖酶的最适温度、最适pH、热稳定性、酸碱稳定性、以及金属离子对木聚糖酶活性的影响。结果表明，木聚糖酶作用的最适温度为50℃，最适pH为5.0，热稳定性为60℃以下稳定性较高，以上稳定性很差，酸碱稳定性为pH7以下时稳定性较高，7以上很差，到9则失活，金属离子的影响为Fe2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+对木聚糖酶的酶活力有不同的促进作用，Mn2+对木聚糖酶的酶活力则有抑制作用。
4.毕赤酵母重组菌摇瓶发酵条件的研究将重组菌GS115/pGAPHα-xyn2分别置于不同的条件下培养，探讨pH、温度、装液量、培养时间、triton、EDTA对酶产量的影响，确定适合重组菌摇瓶发酵的条件，为工业化生产提供依据。结果表明，重组菌在以下的条件下发酵较为理想：初始pH为5.0，培养温度为28℃，培养时间为120h，装液量为250ml装75ml，Triton添加量为0.01％或EDTA添加量为5mM。在此条件下，重组菌的发酵酶活可达165IU/ml或153IU/ml。
5.木聚糖酶的酶解产物分析用重组木聚糖酶水解木聚糖，采用TLC法分析酶解产物。实验表明，木聚糖酶的酶解产物为木二糖和木三糖及少量的木糖。说明重组木聚糖酶适用于低聚木糖的生产。