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利用抗重金属砷的大肠杆菌DH5a作为出发菌株,以萤火虫荧光素酶firefly luciferase(luc)基因为报告基因,构建成基因工程重组体。将重组体再导入大肠杆菌DH5a中,成功的构建出抗重金属砷的工程菌株,并研究了工程菌株的荧光强度与砷离子浓度的关系,以及工程菌的性质,以考察工程菌株用于快速检测重金属砷的可行性。同时为了减少本底表达、增加工程菌的灵敏度,对工程菌进行了改进。
采用聚合酶链式反应(PCR)从大肠杆菌DH5a基因组扩增得到重金属砷离子特异性启动子及调控蛋白O/P-arsR,以萤火虫荧光素酶fireflyluciferase(luc)基因为报告基因、pUC18为基础质粒,构建了萤火虫荧光素酶砷离子诱导表达载体pUC18-Luc-arsR。以大肠杆菌DH5a为宿主菌,采用化学转化感受态细胞转化法将pUC18-Luc-arsR导入大肠杆菌DH5a,成功构建砷离子检测工程菌株。工程菌株的研究结果如下:
1.工程菌pUC18-Luc-arsR.DH5a在培养基中加入不同浓度的AsIII、AsV进行诱导,当AsIII浓度小于10μM时,荧光强度随AsIII浓度增加而升高;当AsIII浓度在大于10μM时,荧光强度随AsIII浓度增加而下降的分布;当AsV浓度小于100μM时,荧光强度随AsIII浓度增加而升高;当AsV浓度在大于100μM时,荧光强度随AsV浓度增加而下降的分布。
2.分别采用10种重金属离子(Cd2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Pb2+、Zn2+、Sn2+、Sb3+、Bi3+)对工程菌株进行诱导试验,通过测定荧光强度考察工程菌株对砷离子的特异性。工程菌株对砷以外的重金属离子基本没有响应,仅对砷产生明显的效应,说明工程菌株对砷离子具有较好的特异性。
3.当工程菌株砷离子的诱导浓度为1mM时,利用扫描能谱与液相色谱.电感耦合等离子体质谱仪(HPLC-ICP-MS)联用技术,对工程菌株的细胞表面与细胞内不同形态砷的含量进行测定。细胞表面的砷含量:亚砷酸钠诱导4h比诱导1h高,而砷酸三钠诱导4h比诱导1h高。细胞内部不同形态砷的含量变化:砷酸三钠诱导1h与诱导4h细胞内总砷的含量几乎相同,大约为38ppb,而诱导1h时AsV大于.AsIII的含量;诱导4h时,正好相反,AsIII大于AsV的含量;亚砷酸钠诱导1h比诱导4h砷的含量高。
4.为了降低本底表达,对重组质粒pUC18-Luc-arsR进行改进,在O/P-arsR序列后再引入一个O/P结构,构建了重组质粒pUC18-Luc-20/P-arsR,很大程度上降低了本底表达,提高了灵敏度。
实验表明,利用以萤火虫荧光素酶(luc)基因为报告基因的工程菌株pUC18-Luc-arsR.DH5a及改进的pUC18-Luc-20/P-arsR.DH5a有望建立起一种方便快捷的重金属砷的检测方法-微生物全细胞传感器法,具有很强的应用价值。