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研究背景和目的:红系造血岛(Erythroblastic island,EBI)由一个中央巨噬细胞及围绕其周围的不同分化阶段的红细胞组成,是第一个被发现的造血龛。EBI巨噬细胞对红系发育具有重要调控作用,是红系发育领域的热点和难点。多年来研究者发现了多种可能的EBI巨噬细胞表面分子标记,EBI巨噬细胞调控红系发育的理论不断得到完善,然而由于始终未能发现鉴定和分离高纯度EBI巨噬细胞的方法,EBI巨噬细胞本身功能及其支持红系发育机理的研究受到了很大的阻碍。鉴于促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)对红细胞生成是必需的,EPO受体(Erythropoietin Receptor,EPOR)亦在多种非红系细胞中表达。因此,我们推测EBI巨噬细胞表达EPOR,这样EPO就可以同时作用于红系细胞以及EBI巨噬细胞从而保证高效的红细胞生成。为了验证这一假说,本课题拟结合Epor-eGFPcre小鼠模型、人胎肝以及体外共培养体系,综合运用流式细胞术、Imagestream、RNA-seq、单细胞测序(Single cell RNA-sequence,Sc-RNA-seq)等方法对EBI巨噬细胞进行详细系统地研究,构建EBI巨噬细胞鉴定和分离体系,明确其生物学特征,为深入了解EBI巨噬细胞支持红系发育的作用机理提供新的理论,也为未来研究EBI巨噬细胞在地中海贫血(β-thalassemia)、真性红细胞增多症(Polycythemia vera,PV)和骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic syndrome,MDS)等血液系统疾病中的作用提供重要的依据。研究方法(1)EBI巨噬细胞的鉴定、分离和免疫表型分析:利用流式细胞术结合细胞计数证明并不是所有的F4/80+Vcam1+CD169+巨噬细胞都是EBI巨噬细胞;在Epor-eGFPcre小鼠骨髓和胎肝以及人胎肝中,利用流式细胞术、流式细胞分选术和Imagestream方法鉴定并分离小鼠骨髓和胎肝以及人胎肝EBI巨噬细胞,并根据已知的对红系发育起重要作用的表面标记物分析其免疫表型。(2)EPO促进EBI形成的研究:小鼠进行EPO注射后,利用流式细胞术、细胞计数、Imagestream对小鼠骨髓和脾脏中有核红细胞数目、EBI巨噬细胞数目、EBI数目以及小鼠骨髓EBI巨噬细胞粘附分子CD163、CD169和Vcam1进行检测;检测人CD34+造血干细胞来源的巨噬细胞CD163、CD169和EPOR的表达,EPOR的表达同时利用EPO刺激后的信号转导进行验证;晚期红系细胞与人EBI巨噬细胞体外共培养检测EPO对人EBI形成的影响。(3)EBI巨噬细胞转录组学分析:利用分离小鼠骨髓EBI巨噬细胞的方法,分选出高纯度的小鼠骨髓EBI巨噬细胞,进行RNA-seq检测,并应用生物信息学软件进行转录组学分析;用同样的方法对人胎肝EBI巨噬细胞进行RNA-seq测序和转录组学分析;对RNA-seq检测发现的特异高表达分子进行q RT-PCR和流式细胞术或者Western Blot检测在m RNA和蛋白水平分别进行验证。(4)人胎肝EBI巨噬细胞异质性研究:利用流式降维分析法、Cytospins以及Imagestream分析人胎肝不同类型的EBI;分选出人胎肝EBI巨噬细胞进行10X Genomic单细胞测序,利用生物信息学软件进行分析,阐释不同功能的EBI巨噬细胞亚群。结果EBI巨噬细胞的鉴定、分离和免疫表型分析(1)定量结果显示小鼠骨髓中F4/80+Vcam1+CD169+巨噬细胞数:有核红细胞数为1:2.6,而文献报道一个EBI巨噬细胞其周围围绕有核红细胞数目为5-30个;因此,并不是所有的F4/80+Vcam1+CD169+巨噬细胞都是EBI巨噬细胞;小鼠骨髓中约5%的F4/80+巨噬细胞是Epor-eGFP+,胎肝中约31%的F4/80+巨噬细胞是Epor-eGFP+;分选小鼠骨髓和胎肝F4/80+Epor-eGFP+和F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞发现他们形态差异很大,提示他们属于不同的巨噬细胞亚群。(2)Imagestream检测发现小鼠骨髓和胎肝中超过90%的EBI是由F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞形成的,其中小鼠骨髓中EBI巨噬细胞周围围绕3个、4个和5个及以上有核红细胞的比例分别是约20%、26%和54%;而小鼠胎肝中EBI巨噬细胞周围围绕3个、4个和5个及以上有核红细胞的比例分别是约10%、20%和70%;Imagestream结果显示在小鼠骨髓和胎肝中超过90%的吞噬红细胞核的巨噬细胞是F4/80+Epor-eGFP+;Imagestream结果显示小鼠骨髓中超过90%的EBI巨噬细胞表达Vcam1、CD169和ER-HR3,约35%的EBI巨噬细胞表达CD163,约52%表达Ly6C以及约32%表达CD11b;之外,Ly6G之前被认为是EBI巨噬细胞的一个分子标记,在所有EBI巨噬细胞中均不表达。(3)流式细胞术检测结果显示小鼠骨髓中所有的F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞和F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞均表达CD45;大部分F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞是CD11bmedi/-,而68%的F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞表达CD11b;约90%的F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞表达ER-HR3,而仅约52%的F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞表达ER-HR3;虽然大部分F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞和F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞均表达CD169和Vcam1,但是对比F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞,F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞具有较高水平的CD169和Vcam1的表达;F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞中约35%表达CD163,而F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞均不表达CD163;F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞中约69%表达Ly6C,而F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞中约57%的细胞表达Ly6C;这些结果提示F4/80+Epor-eGFP+和F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞具有明显的免疫表型差异。(4)流式细胞术检测结果显示在人胎肝CD163+巨噬细胞中约27%表达EPOR,Imagestream结果显示超过90%的人胎肝EBI是由CD163+EPOR+巨噬细胞形成的;分选的CD163+EPOR+巨噬细胞和CD163+EPOR-巨噬细胞形态差异很大,且在CD163+EPOR+巨噬细胞中可观察到吞噬细胞核和衰老红细胞的现象。EPO促进EBI形成的研究(1)分选的小鼠骨髓F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞具有接受EPO刺激后信号转导反应,而F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞对EPO无反应;EPO注射后导致小鼠骨髓有核红细胞、EBI巨噬细胞以及EBI数明显增加;EBI增多的原因至少部分是由于EPO注射后EBI巨噬细胞Vcam1表达升高引起的;EPO注射后脾脏代偿性造血的EBI也是由F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞形成的,脾脏有核红细胞、EBI巨噬细胞以及EBI数目亦明显增加。(2)人脐带血CD34+造血干细胞来源的巨噬细胞表达CD163、CD169和EPOR;EPO刺激后STAT5和ATK磷酸化明显升高进一步证明了EPOR的表达;体外岛屿形成实验显示EPO可以促进人EBI的形成。小鼠和人EBI巨噬细胞的转录组学分析(1)小鼠骨髓巨噬细胞RNA-seq结果提示F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞具有特殊的支持红系发育的功能如红系发育、受体介导的内吞、凋亡细胞清除、铁稳态等,而F4/80+Epor-eGFP-巨噬细胞则主要与免疫反应和炎症反应等相关。重要的是,已知的与红系发育息息相关的分子如生长因子Igf1、Il18等,粘附分子Vcam1、CD169和CD163,铁代谢分子以及红细胞核吞噬和消化相关分子Mertk、Timd4、Dnase2α、Trf、Homox1、Slc40a1等均在F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞中高表达。除此之外,四个转录因子Klf1、Spic、Nr1h3和Maf选择性地在F4/80+Epor-eGFP+巨噬细胞中表达,提示其在EBI巨噬细胞中的选择性调控作用。(2)人胎肝巨噬细胞RNA-seq结果提示人胎肝EBI巨噬细胞上调的信号通路主要与脂类代谢、受体介导的内吞、细胞粘附、细胞外基质重塑等功能相关,而CD163+EPOR-巨噬细胞主要和免疫反应、炎症反应、趋化等功能相关;CD163+EPOR+巨噬细胞高表达促进早期红细胞增殖的细胞因子IGF2、CXCL12等,与红细胞粘附的分子VCAM1、CD163、CD169、EMP等,吞噬和铁代谢相关分子如MERTK、AXL、TIMD4、HMOX1、SLC40A1、TRF等;除此之外,转录因子SPIC、NR1H3、PPARG、KLF1、TLX1、EPAS1和ETV5选择性地表达于CD163+EPOR+巨噬细胞,提示其对EBI巨噬细胞的选择性调控作用。人胎肝EBI巨噬细胞异质性研究(1)Cytospins和Imagestream结果显示人胎肝存在不同类型的EBI,如周围主要围绕早期红细胞的,周围主要围绕晚期红细胞的,吞噬红细胞脱出的细胞核的等;流式降维分析结果显示人胎肝EBI巨噬细胞存在明显异质性。(2)Sc RNA-seq分析结果显示人胎肝EBI巨噬细胞存在不同的功能亚群,主要有四群:一群是分泌细胞因子支持早期红系细胞增殖的;一群是周围围绕不同期别红细胞,监视红系发育进程清除异常红细胞的;一群是为晚期红细胞成熟供铁的;一群主要起到消化红细胞核。结论:(1)在小鼠骨髓和胎肝以及人胎肝中EBI巨噬细胞表达EPOR,且EPO可以通过调控其功能促进EBI形成。(2)EBI巨噬细胞通过分泌生长因子、直接与红细胞粘附、为晚期红细胞合成血红蛋白提供铁以及吞噬红细胞脱出的细胞核等方式支持红系发育。(3)EBI巨噬细胞存在异质性,在人胎肝中存在四个不同功能的EBI巨噬细胞亚群。