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根据已知的禽流感病毒(AIV)A／Chicken／Guangdong／25／2000(H5N1)毒株和A／Chicken／Guangxi／KMIII／1999(H9N2)毒株的HA基因序列和表达载体pET-32a(+)、pET-28a(+)的多克隆位点，设计并合成含保护碱基和BamHI、HindlII酶切位点的引物，成功扩增出它们的HA基因完整开放阅读框架(0RF)，其长度分别为1707bp和1683bp，然后构建了原核表达质粒，分别命名为pET32-HA5、pET28-HA9。引物设计时，切除了pET32-HA5的起始密码子ATG，但保留了pET28-HA9的起始密码子ATG和各自的终止密码子。
将含有重组质粒pMD-HA5和pMD-HA9的菌种分别增菌培养后，抽提质粒，利用PCR的方法分别获得了约为1707bp和1683bp的DNA目的条带，成功扩增出HA基因。将纯化的PCR扩增产物经双酶切、连接、转化，分别亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)、pET-28a(+)中，在选择性LB固体培养基上筛选出阳性克隆。经PCR鉴定和单、双、特异性酶切鉴定均为阳性的转化子，通过测序作进一步鉴定，成功构建了重组表达质粒pET32-HA5、pET28-HA9，并证实克隆的基因分别为H5N1、H9N2亚型禽流感病毒HA基因HA5、姒9；HA5基因由1707个核苷酸组成，编码568个氨基酸；HA9基因由1683个核苷酸组成，编码560个氨基酸。
将重组表达质粒pET32-HA5、pET28-HA9分别转化进表达菌BL21(DE3)pLysS中，经IPTG诱导后进行SDS-PAGE蛋白质电泳，初步测得目的蛋白的相对分子量分别约为85KDa和63KDa，与理论计算值一致。超声波破菌处理后经SDS-PAGE蛋白质电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式存在。用超声波破菌提取包涵体，SDS-PAGE蛋白质电泳后切下目的条带再用透析法复性浓缩，获得纯化的重组蛋白。Western-blotting分析显示：重组蛋白具有良好的反应原性，均能与特异的抗血清发生显色反应，从而为以HA重组蛋白为免疫抗原制备多克隆抗体奠定了基础。
SDS-PAGE蛋白质电泳后，切下目的条带在低温下研磨后加入弗氏完全佐剂(一免)、弗氏不完全佐剂(二、三免)制成油乳剂疫苗；用此油乳剂疫苗三次免疫并用纯化的重组蛋白超免新西兰雄兔，制备高免血清。同时用琼脂扩散试验、血凝抑制试验和Western-blotting试验等对高免血清的效价和特异性进行鉴定，结果显示高免血清均有较高的效价和良好的免疫特异性，从而为今后制备抗HA重组蛋白的荧光抗体奠定了基础。
先用硫酸铵盐析法、透析法和SephadexG25层析法除盐、透析法浓缩蛋白溶液等结合，从高免血清中纯化出免疫球蛋白IgG；再用搅拌法标记荧光素、SephadexG25层析法去除游离荧光素、透析法浓缩蛋白溶液等结合，制备抗HA重组蛋白荧光抗体。经测定，标记的荧光抗体最适工作浓度HA5荧光抗体为4lig2，HA9荧光抗体为5log2；同时用阳性血清封闭试验、荧光抗体吸收试验等对荧光抗体进行检验，结果表明HA5、HA9荧光抗体均具有敏感、特异性强等优点，而且该检测方法简便、快速，在一般实验条件下用自制的荧光抗体在2～3小时内就能对是否感染有相应禽流感病毒的MDCK细胞作出检测。
本试验对H5N1、H9N2~型禽流感病毒姒基因HA5、HA9进行了亚克隆和原核表达，获得了较好的表达效果，为更廉价、简便的方式获取大量的诊断用抗原和制备基因工程疫苗提供技术积累和尝试。同时，本试验用自制的荧光抗体检测禽流感病毒获得了较好的效果，该方法有望成为实验室检测禽流感病毒的有效方法。