我国是世界上高原地区面积最大、边境线最长、定居人口最多的国家。高原地区环境特殊,其氧含量低、温度低、湿度低、温差大、紫外线辐射强。其中氧含量的下降对机体影响最为严重。脑是对缺氧最敏感的器官,对缺氧的耐受性也最差。当氧的供应不能满足大脑需要时,脑的代谢、功能和形态结构发生一系列变化,严重时甚至出现脑水肿等危及生命的病理改变。缺氧导致的脑损伤是一个动态的、多因素相互作用的、渐进性的发展过程,涉及血管内皮细胞损伤、脑组织间质水肿、细胞的水肿变性和坏死等。高原低氧环境常伴随胃肠功能的紊乱、炎症以及感染风险的增加。研究发现在高原登山人群中,发生胃肠道或呼吸道感染等引发炎症反应的人群更容易患急性高山病,且其路易斯湖评分与炎症严重情况成正相关。有报道发现急性高山病患者血浆促炎细胞因子的表达出现明显上调。而炎症在高原脑水肿发生中的作用尚缺乏研究。血脑屏障是机体维持中枢神经系统内环境稳定的结构基础,由脑血管内皮细胞、周细胞、星型胶质细胞的终足及血管外基膜构成。相邻的脑血管内皮细胞通过紧密连接蛋白紧紧的连接在一起,使血管中大小分子不能通过细胞旁路途径进入中枢神经系统;脑血管内皮细胞胞吞与胞饮的频率极低,同时表达特异的转运蛋白,从而限制了血管中大小分子通过跨细胞途径进入中枢神经系统。同时周细胞、星型胶质细胞和血管外基膜通过多种分子通路与脑血管内皮细胞相互作用,参与血脑屏障形成及稳定的调节。细胞粘附分子在介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间粘附识别,维持细胞结构完整和细胞间信号转导中发挥了重要作用。神经粘附分子NB-3是细胞粘附分子免疫球蛋白超家族的成员。研究显示NB-3通过亲同性作用和亲异性作用参与神经干细胞的分化、神经元突起的生长及导向、神经元的存活与凋亡以及轴突再生的调节。同时NB-3在自闭症、智力障碍、精神分裂症、多动症、双相障碍、厌食症等精神疾病中发挥重要功能。实验室前期工作显示NB-3敲除明显加重小鼠脑缺血造成的损伤,同时NB-3敲除小鼠表现出对缺氧的不耐受。因此围绕高原脑水肿的发生我们探讨了NB-3在其中发挥的作用及其可能调节机制。研究目的越来越多的实验研究及临床调查提示炎症反应在急性高山病和高原肺水肿发生中的重要作用,炎症反应在高原脑水肿发生中的作用却鲜有报道。因此我们首先研究了炎症反应在高原脑水肿发生中的作用。高原脑水肿发生的关键事件是血脑屏障的破坏。血脑屏障作为一个多细胞的结构,介导细胞间相互作用的细胞粘附分子可能发挥了重要作用。研究显示NB-3在神经系统损伤,尤其是缺氧性损伤中发挥了重要作用。因此我们评价了NB-3在高原脑水肿发生中的作用,并探索了其发挥功能的可能机制。研究内容本研究主要分为两部分:一、基于炎症反应在急性高山病发生中的作用,我们讨论了炎症反应在高原脑水肿发生中的作用及调节机制。二、基于上述小鼠高原脑水肿模型,使用NB-3敲除小鼠,我们进一步探讨了NB-3在高原脑水肿发生中的作用及其可能机制。具体研究思路如下图所示:高原低氧暴露加重LPS引起的炎症反应并促进高原脑水肿的形成 神经粘附分子NB-3缺失加重高原脑水肿的进展研究方法采用干湿重法、MRI,我们评价了小鼠的脑含水量变化;通过检测伊文斯兰和Ig G的漏出,我们评价了血脑屏障通透性的变化;通过Real-time PCR法,我们对小鼠脑组织中特定基因的转录进行检测;通过ELISA法,我们对血清中的细胞因子进行检测;通过免疫荧光法,我们对星型胶质细胞、小胶质细胞的激活进行了评价,对NB-3在不同细胞的表达定位进行检测,对紧密连接蛋白的细胞内定位改变进行评价,对血管的扩张进行评价;通过激光散斑成像技术,对小鼠头部血流进行检测;通过Western blot法,对低氧相关蛋白、水肿发生相关蛋白、紧密连接蛋白等进行检测;通过透射电镜,对小鼠脑组织超微结构进行检测;通过HE染色,Nissl染色和Thy-1-YFP转基因小鼠,我们对小鼠的组织形态和神经元损伤进行评价;通过Morris水迷宫和Rota-Rod测试,我们评价了小鼠的空间记忆及运动协调功能的改变。研究结果第一部分高原低氧加重LPS引起的炎症反应并引起高原脑水肿的发生1.高原低氧上调血清与脑组织中促炎细胞因子的表达给予小鼠不同时间高原低氧暴露,随着暴露时间的延长,小鼠血清中IL-1β与IL-6出现上调,并且随着暴露时间的延长,其上调愈加明显。小鼠脑组织中TNF-α在暴露12小时出现上调,在高原低氧暴露24小时后,脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α均出现明显上调。2.高原低氧加重LPS引起的炎症反应并引起脑水肿的发生给予小鼠腹腔注射不同剂量的LPS,发现低剂量LPS对小鼠脑含水量并无明显影响(<5 mg/kg)。但是在高原低氧条件下,小鼠脑含水量出现明显增加。同时,血清及脑组织中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达明显上调。3.高原低氧复合LPS引起脑内小胶质细胞及HIF通路激活对小鼠脑组织中小胶质细胞及星型胶质细胞的激活情况进行检测,发现LPS可以引起脑内小胶质细胞出现激活,而对星型胶质细胞无明显影响。我们接着对小鼠脑组织中HIF通路进行检测发现在高原低氧及LPS复合作用下,HIF信号通路出现明显激活,HIF-1α、HIF-2α、VEGF的表达出现明显上调。4.高原低氧复合LPS显著增加血脑屏障通透性对血脑屏障通透性进行检测发现高原低氧暴露及LPS对小鼠血脑屏障通透性无明显影响。在二者复合作用下,血脑屏障通透性明显在增加。电镜显示细胞间紧密连接出现开放;Western blot显示紧密连接蛋白Occludin及粘附连接蛋白VE-Cadherin出现明显下调。5.高原低氧复合LPS引起小鼠脑组织神经元损伤小鼠脑组织形态观察显示高原低氧及LPS对小鼠脑组织整体形态并无明显影响。在二者复合作用下,HE染色显示脑组织中部分细胞出现胞浆淡染及核深染样改变;Nissl染色显示尼氏小体数量减少,颜色变浅;Thy-1-YFP转基因小鼠显示投射神经元数量减少,轴突出现萎缩。6.高原低氧复合LPS引起小鼠认知与运动协调功能障碍通过Morris水迷宫及Rota-rod实验对小鼠的认知及运动协调功能进行检测发现高原低氧及LPS对小鼠的认知及运动协调功能无明显影响。在二者复合作用下,小鼠首次穿越平台的潜伏期明显延长,穿越平台的次数、在目标象限运动的时间及路程明显减少;小鼠从转动的滚木上掉落的潜伏期及掉落时滚木的转速明显减少。第二部分NB-3的缺失加重高原脑水肿的发生发展1.神经粘附分子NB-3表达于中枢神经系统神经元分离小鼠不同的组织器官,Western blot检测显示NB-3只在脑组织中表达,且NB-3在脑组织不同脑区表达丰度不一。通过对NB-3免疫荧光染色标记显示NB-3和神经元标记物NeuN有共定位现象,而与星型胶质细胞、周细胞、小胶质细胞及血管内皮细胞标志物无共定位现象。2.高原低氧下调脑组织中NB-3的表达给予小鼠不同时间高原低氧暴露,发现高原低氧可以引起NB-3的表达下调,并且随着高原低氧暴露时间的延长,NB-3的下调愈加明显。3.NB-3敲除加重HACE的发展在发生HACE时,与WT小鼠相比,NB-3敲除小鼠脑含水量上升更加明显,并出现20%的死亡率;NB-3敲除小鼠血脑屏障通透性的增加更加明显,有更多的伊文斯兰和Ig G从血管中漏出。4.NB-3敲除加重HACE条件下外周及中枢神经系统炎症反应对不同组小鼠血清及脑组织中炎症相关细胞因子检测显示,在发生HACE时,NB-3敲除小鼠血清及脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的上升均较野生小鼠更加剧烈;NB-3敲除小鼠脑组织中小胶质细胞的激活也更加明显。5.NB-3敲除加重HACE条件下紧密连接的开放在发生HACE时,电镜显示NB-3敲除小鼠血管内皮细胞间紧密连接的开放、基膜的降解、线粒体的肿胀更加严重;Western blot显示紧密连接蛋白Occludin及Claudin-5的下调更加明显;免疫荧光显示紧密连接蛋白Occludin及Claudin-5血管内定位改变更加剧烈。6.NB-3敲除加重HACE条件下脑部血管扩张对小鼠脑组织大小血管进行标记发现,在发生HACE时,NB-3敲除小鼠脑组织中大小血管的扩张较WT小鼠相比更加剧烈。对其脑部血流进行检测显示NB-3敲除小鼠脑部血流的上升也更加明显。7.NB-3敲除加重HACE条件下神经元的损伤对小鼠脑组织形态观察发现:在发生HACE时,HE染色显示NB-3敲除小鼠脑组织中出现胞浆淡染及核深染的细胞更加普遍;Nissl染色显示尼氏小体数量的减少及淡染更加明显;Thy-1-YFP+NB-3敲除小鼠投射神经元的减少及轴突萎缩更加严重。8.NB-3敲除加重HACE条件下小鼠认知与运动协调功能障碍Morris水迷宫及Rota-rod实验显示:在发生HACE时,NB-3敲除小鼠首次穿越平台的潜伏期延长更加明显,穿越平台次数、在目标象限运动时间和路程的减少更加明显;从转动的滚木上掉落的潜伏期及掉落时滚木转速减少更加明显。9.NB-3可能通过影响VEGF通路参与血脑屏障稳定的调节在发生高原脑水肿时,NB-3在星型胶质细胞的终足出现表达。在发生HACE时,不同小鼠脑组织中MMP-9和VEGF的表达及活性并无明显差异,但WT小鼠脑组织中VEGFR2的含量较NB-3敲除小鼠下降明显。同时WT小鼠脑组织中出现Notch1信号通路的激活,而NB-3敲除小鼠中Notch1信号通路并未出现激活。研究结论本研究阐明了高原低氧可以明显加重机体的炎症反应,从而引起血脑屏障通透性的增加及神经元的损伤,导致高原脑水肿的发生。在发生高原脑水肿时,NB-3的缺失可以通过加重机体的炎症反应、加重血管的扩张及紧密连接蛋白的降解,增加血脑屏障的通透性,引起神经元的损伤加重,进而促进高原脑水肿的进展。该研究明确了炎症反应在高原脑水肿中的调节作用,以及神经粘附分子NB-3在高原脑水肿发生中的保护作用。该研究使我们对高原脑水肿的发生与发展有了进一步的认知,也为高原脑水肿的预防与治疗提供了新的靶点和思路。