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钒(V)引起蛋鸡输卵管膨大部氧化应激和细胞凋亡,引起鸡蛋品质下降,且对人体健康有潜在危害。本论文通过3个体外试验,探究了 V对于蛋鸡输卵管膨大部上皮细胞(OMECs)产生氧化应激和细胞凋亡的可能信号途径,揭示了 V引起鸡蛋品质的下降的可能机制,为缓解蛋鸡V中毒提供理论依据,具有重要的学术价值。试验一:钒诱导蛋鸡输卵管膨大部上皮细胞氧化应激模型的建立本试验选用开产前2～3周的健康罗曼蛋鸡,对其OMECs进行分离培养和鉴定,利用偏钒酸铵(V5+)构建其氧化应激模型。利用培养的OMECs采用6个V5+浓度梯度(0、25、50、100、250、1000 μmol/L)和 5 个时间点(1h、4h、12h、24h、48h),共30个处理,测定细胞活力,确定V作用时间。然后采用单因素试验设计,包括6个V浓度水平(0,25,50,100,250,1000μmol/L)处理12 h(通过细胞活力确定)后测定细胞凋亡、活性氧(ROS)的生成、相关酶活性表达。结果显示,1)OMECs接种24 h后形成细胞岛;通过形态学观察发现,所培养的细胞呈卵圆形,单层生长;且利用免疫荧光技术显示,细胞对抗细胞角蛋白(CK-18)呈阳性,对抗波形蛋白呈阴性;且对抗卵清蛋白(OVA),雌激素受体(ESR1)和孕酮受体(PGR)均呈阳性。2)50和100 μmol/L的V处理OMECs后,其细胞活力显著下降(P<0.05),但高于250和1000 μmol/L的V处理组(P<0.05)。3)OMECs的细胞凋亡率与V呈剂量效应,1000 μmol/L的V引起的细胞凋亡率最高,且各剂量V浓度诱导的细胞凋亡率差异显著(P<0.05)。4)流式细胞仪测定ROS结果显示,100和250 μmol/L的V引起的FITC平均值显著高于0 μmol/L的V处理组(P<0.05),且100 μmol/L的V引起的 FITC 平均值低于 250 μmol/L 的 V(P<0.05)。5)50 μmol/L 的 V 引起 OMECs 的超氧化物歧化酶(SOD)活性显著低于0 μmol/L的V处理组(P<0.05),但其处理间的丙二醛(MDA)含量差异不显著,MDA在100μmol/LV处理组中显著升高(P<0.05)。其次,100μmol/LV处理组中的过氧化氢酶(CAT)活性高于0μmol/LV处理组(P<0.05)。细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性随着V的添加量的增多而升高,且100 μmol/L的V引起的LDH活性显著高于0μmol/L的V(P<0.05)。试验二:MAPK介导钒引起蛋鸡输卵管膨大部上皮细胞氧化应激的可能机制利用培养的OMECs,采用单因素试验设计,包括0 μmol/LV(control)、100 μmol/L V(V100)、V100+SB203580(P38MAPK 抑制剂)、SB203580、V100+U0126(ERK1/2抑制剂)、U0126、V100+SP600125(JNK抑制剂)、SP600125,共计8个处理。测定细胞活力、胞内ROS的生成、相关抗氧化酶活、RT-PCR相关基因mRNA表达和Western blot相关蛋白表达。结果表明:1)V100显著降低细胞活力(P<0.05),SB203580和SP600125能有效削弱V对于细胞活力产生的副作用(P<0.05)。2)三种MAPK抑制剂预处理均能在一定程度上抑制V引起的胞内ROS的生成(P<0.05)。3)V100显著降低SOD、CAT和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性(P<0.05),而U0126有增加SOD活性的趋势(P=0.06);SB203580(P<0.05)能增加CAT的活性,SP600125有增加CAT活性的趋势(P=0.08);在SB203580或U0126预处理的情况下,GSH-Px活性显著升高(P<0.05)。三种MAPK抑制剂均能缓解V100引起的MDA含量和上清液LDH活性的升高(P<0.05)。4)V100可下调P38MAPK、ERK1/2、JNK、Nrf2、sMaf、GCLC、NQO1 和 HO-1 的 mRNA 表达(P<0.05),而SP600125预处理OMECs后,能在一定程度缓解V100引起的P38MAPK、ERK1/2、JNK、Nrf2、GCLC、和HO-1 的 mRNA 下调(P<0.05),SB203580 对于 JNK、NQO1和HO-1以及U0126对于ERK1/2、GCLC和HO-1有一定缓解作用(P<0.05)。5)V100 对 P38MAPK、ERK1/2、JNK、Nrf2、sMaf 和 HO-1 的蛋白无显著作用,但是V100 增加了 P38MAPK、ERKl/2、JNK 和 Nrf2 蛋白的磷酸化表达(P<0.05),SP600125可降低V100引起的这些蛋白的磷酸化(P<0.05),而SB203580能降低P38MAPK和Nrf2的磷酸化(P<0.05)。试验三:MAPK介导钒引起蛋鸡输卵管膨大部上皮细胞凋亡的可能机制利用培养的OMECs,采用单因素试验设计,包括0 μmol/L V(control)、100μmol/L V(V100)、V100+SB203580(P38MAPK 抑制剂)、SB203580、V100+U0126(ERK1/2抑制剂)、U0126、V100+SP600125(JNK抑制剂)、SP600125,共计8个处理。测定细胞凋亡、上清液中LDH的生成、线粒体膜电位的变化、RT-PCR相关基因的mRNA表达。结果显示:1)Vl00增加OMECs的细胞凋亡(P<0.05),三种MAPK抑制剂能在一定程度上缓解V100诱导的细胞凋亡(P<0.05)。2)V100使细胞上清液中LDH的活性显著升高,与V100处理12h后相比,利用P38MAPK、ERK1/2或JNK抑制剂预处理OMECs,能减少LDH的活性(P<0.05)。3)V100引起OMECs线粒体膜电位去极化程度增加(P<0.05),SB203580和U0126能缓解V100引起的线粒体膜电位的下降(P<0.05)。4)V100能下调B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶1(PARP1)的mRNA表达(P<0.05),上调B细胞淋巴瘤因子相关x蛋白(Bax)、细胞色素C(CytC)和半胱氨酸天冬酶3(Caspase-3)的mRNA表达(P<0.05)。二种抑制剂均能缓解V100引起的Bax和Caspase-3的mRNA上调和Bcl-2的 mRNA 下调(P<0.05);SB203580 和 U0126 能上调 V100 处理下 Cyt C 的 mRNA水平(P<0.05),SP600125差异不显著;SB203580上调V100处理下PPAR1的mRNA水平(P<0.05)。三种MAPK抑制剂均能阻止V100对PPARγ的mRNA水平上调作用(P<0.05)。综上所述,100 μmol/L的V处理12h后可获得理想的OMECs氧化应激模型。V可诱导OMECs产生氧化应激,可能是由于V引起细胞内ROS增多,从而激活P38MAPK和JNK来调控Nrf2的磷酸化,最后通过影响Nrf2信号途径介导II相解毒酶表达下降;且V破坏抗氧化酶系统,抗氧化酶活性降低,使ROS不能及时被清除,造成其过量蓄积,加重了 OMECs的氧化应激。V可引起OMECs发生细胞凋亡,可能是通过磷酸化P38MAPK和ERK1/2,引起Bax/Bcl-2比例增加,造成OMECs的线粒体膜电位去极化程度增高,引起Cyt C释放增多,招募并激活Caspase-3,造成PARP1裂解,最终导致OMECs细胞凋亡。因此,以上结果表明MAPK信号通路参与了 V诱导的OMECs细胞的氧化应激和凋亡。