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目的二甲基甲酰胺(DMF)是一种具有很强溶解能力的有机物质,曾被誉为“万能溶剂”。在室温条件下,DMF能够与水、酮、酯、醚、醇、氯化烃和芳烃等有机物以任何比例完全混溶。在工业中,可以作为聚胺酯人造革及合成革的加工溶剂,以及作为萃取剂参与医药和染料的生产过程,用途十分广泛;DMF有一定的挥发性,在工业企业的生产过程中,如果没有合理的防护,DMF会通过呼吸及皮肤接触进入机体,对职业工人的消化系统、生殖系统、免疫系统等造成健康危害。DMF进入机体后,肝脏为其靶器官,能够导致肝脏出现ALT和AST等肝酶升高、肝脏系数增大、肝细胞坏死等肝脏损伤表现,并能特异性地产生血红蛋白加合物(NMHb)。在DMF的代谢过程中,CYP450家族的Cyp2e1酶起到了非常重要的作用。本研究通过敲除小鼠Cyp2e1基因对CYP2E1在DMF代谢中的作用进行研究。通过建立DMF致小鼠急性肝毒性效应模型,探讨DMF所致的急性肝毒性效应及CYP2E1在代谢过程中的作用。并通过检测氧化抗氧化和内质网应激相关指标的水平,探究产生肝损伤的可能机制。方法1、建立Cyp2e1基因敲除小鼠:通过TALEN技术对小鼠Cyp2e1基因进行敲除,显微注射导入到受体C57BL/6母鼠中,产生基因敲除杂合子。通过杂合子之间的交配,产生Cyp2e1基因敲除纯合型小鼠。通过一代测序鉴定小鼠基因型、Western blot法检测Cyp2e1蛋蛋表达含量、高效液相色谱法检测Cyp2e1酶活性;2、建立DMF致小鼠急性肝毒性效应模型:选取12周龄基因敲除纯合型雌雄性小鼠各32只,及相等数量相应周龄的C57BL/6野生型小鼠。将小鼠按照基因型和性别不通过分成雄性野生型、雌性野生型、雄性纯合型、雌性纯合型4个大组,每大组中的小鼠随机分为对照组、染毒后24 h组、染毒后48 h组和染毒后72 h组。染毒剂量为1500mg/kg·bw,单次灌胃染毒后,根据不同恢复时间处死动物;并通过计算肝脏系数、检测肝酶水平和观察肝脏病理组织学推断DMF所致肝脏急性毒性效应;3、血红蛋白加合物和CYP2E1:通过高效液相色谱法检测血液中NMHb的含量观察DMF在小鼠体内的代谢情况;通过检测Cyp2e1mRNA水平、Cyp2e1蛋白水平和酶活性提示CYP2E1在DMF代谢中的作用;4、小鼠氧化抗氧化说和内质网应激的相关指标:选取GSH和MDA作为氧化应激的指标,选取SOD和GSH-Px作为抗氧化酶指标;选取GRP94和GRP78作为内质网应激指标。结果1、基因敲除小鼠的建立:一代测序DNA序列图谱可见Cyp2e1基因敲除纯合型小鼠序列第166位插入了一个碱基C且无杂峰;Western blot检测纯合型小鼠Cyp2el蛋白表达量远低于野生型小鼠;酶活性检测可见纯合型小鼠与酶自身性质相关的Km值与野生型相差不大,与酶含量相关的Vmax远低于野生型小鼠;2、DMF致小鼠急性肝毒性效应:雌雄性野生型小鼠在染毒后三个时间点出现肝脏系数、肝酶ALT和AST水平显著升高,纯合型小鼠肝酶水平改变无统计学差异。野生型小鼠肝脏病理在染毒后出现肝细胞水样变、大片性细胞坏死伴炎细胞浸润,纯合型小鼠在病变的范围和程度上均较野生型小鼠轻;3、血红蛋白加合物和CYP2E1:NMHb检出有特异性,对照组不能检出;雄性野生型小鼠暴露DMF后24 h已基本完成DMF代谢,生成NMHb;雌性野生型小鼠染毒后24 h时NMHb生成量较少,NMHb水平在48 h急剧升高,提示DMF代谢重要发生在24-48 h;纯合型雌雄性小鼠均有少量NMHb生成。PCR检测小鼠Cyp2e1mRNA水平可见染毒后有mRNA水平变化,Western blot实验未见纯合型组明显Cyp2el蛋白条带,野生型小鼠Cyp2e1蛋白在染毒后有先升高后降低的趋势,提示DMF可能引起CYP2E1转录和翻译水平的调控,并可能出现CYP2E1自身抑制;雌雄性野生型小鼠在染毒后48h出现Cyp2e1酶活性下降,提示可能与自身抑制有关;雄性纯合型小鼠酶活性本底值较低,染毒后有升高趋势;4、DMF所致氧化应激和内质网应激:DMF暴露会导致肝脏内GSH含量降低,MDA含量升高,激活体内SOD和GSH-Px等抗氧化酶的活性。内质网应激相关蛋白GRP94和GRP78等蛋白水平在DMF暴露后升高;5、性别差异:血生化结果中雌性野生型小鼠在DMF染毒后出现甘油三酯和胆固醇的升高,而在雄性野生型小鼠中未见两项指标的改变。野生型小鼠因坏死明显而肝脏病理组织学检测未见性别差异,但在纯合型小鼠中差异明显,表现为雄性纯合型小鼠病理组织学改变以肝细胞肿胀为主,雌性纯合型小鼠病理组织学改变以肝脏脂肪变性为主。NMHb观察到DMF的代谢情况,雄性野生型小鼠的DMF代谢主要发生在0-24 h,雌性野生型小鼠DMF代谢主要发生在24-48 h;结论1、成功构建Cyp2e1基因小鼠纯合型;2、CYP2E1在DMF致小鼠急性肝毒性效应中起到了毒物的代谢活化、产生活性氧等重要作用;3、内质网应激为可能的DMF致小鼠肝脏损伤的机制。