番茄（Solanum lycopersicum）是我国广泛种植的富含多种营养成分的果蔬作物,具有遗传背景清晰,生长周期短等优点,是研究植物生长和果实成熟衰老的模式材料。近些年研究发现,H2S作为植物体内的一种气体信号分子,可以参与植物体内多种生理过程,并能延缓多种果蔬的成熟衰老进程。实验室前期研究表明,半胱氨酸脱巯基酶LCD1是介导番茄内源H2S生成的关键酶,LCD1缺失加速番茄果实成熟衰老进程,但LCD1和H2S是否参与调控番茄叶片衰老仍不清楚。实验室前期研究发现LCD1定位于细胞核,利用酵母双杂交实验,发现LCD1与核输入蛋白importinα3之间存在相互作用,但核输入蛋白importinα3是否参与介导LCD1进入细胞核仍需进一步探索。此外,LCD1作为番茄体内的H2S生成酶,而H2S信号可以介导蛋白质的巯基化修饰,LCD1和importinα3的互作是否会导致importinα3发生巯基化修饰,尚不清楚。此外,importinα3是否通过介导LCD1细胞核定位,进而调控番茄果实衰老尚不清楚,需要进一步研究。本文对LCD1在调控叶片衰老中的功能进行了研究,以野生型番茄（Micro Tom）、LCD1过表达、LCD1基因编辑番茄植株作为试验材料,发现LCD1过表达延缓了番茄连体叶片的衰老进程,提高了番茄叶片H2S产生速率及H2S生成量,LCD1缺失则导致叶片衰老加速。为探究LCD1是否参与黑暗条件下离体叶片的衰老进程,以上述三种植株的离体叶片为材料,发现在黑暗处理条件下LCD1缺失导致叶片出现提前黄化的表型,而LCD1过表达离体叶片在黑暗处理8天时仍然较绿,表明LCD1过表达延缓了叶片叶绿素降解进程。在以上三种植物材料的叶片衰老过程中,利用分光光度法,发现LCD1过表达减少了丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）的积累。通过RT-q PCR技术,发现LCD1过表达下调了叶绿素降解关键基因（PPH、SGR1、NYC1、PAO）和衰老相关基因（SAGs）的表达量,而LCD1缺失则上调了叶片衰老相关基因的表达量。为研究外源H2S信号在调控叶片衰老中的功能,利用50μM Na HS作为H2S供体处理野生型番茄叶片,发现在黑暗诱导的叶片衰老进程中,H2S处理延缓叶绿素降解过程,同时抑制H2O2和MDA积累,降低叶绿素降解及衰老相关基因SAGs的表达水平。为探究番茄叶片响应H2S信号延缓衰老的分子机制,对黑暗条件下的对照组和H2S处理组叶片进行转录组测序,通过KEGG分析发现,H2S信号可能通过调控“植物激素信号转导”、“卟啉和叶绿素代谢”以及“次生代谢物的生物合成”等多种途径,进而延缓黑暗诱导条件下的叶片衰老进程。前期试验结果表明,LCD1具有细胞核定位,核输入蛋白importinα3可能是介导LCD1进入细胞核的关键蛋白。本文利用荧光素酶互补实验,进一步验证importinα3与LCD1之间存在相互作用。此外,利用生物信息学分析发现importinα3具有IBB结构域和多个ARM结构域,且其具有潜在的核定位信号序列。通过构建importinα3-GFP载体并利用激光共聚焦显微技术,发现importinα3具有显著的细胞核定位,同时其在细胞质中也有分布。同时,为探究importinα3能否发生巯基化修饰,通过构建importinα3-his原核表达载体,表达importinα3蛋白并纯化,在H2S信号处理条件下,利用生物素开关法结合Western blot技术,发现核输入蛋白importinα3具有巯基化修饰信号。为进一步明确importinα3蛋白中可能发生巯基化修饰的半胱氨酸（Cys）位点,将importinα3蛋白进行质谱检测,结果表明importinα3蛋白第351位Cys具有巯基化修饰信号。为探究importinα3在番茄果实成熟衰老进程中的功能,利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）和Crispr/Cas9基因编辑技术,构建了importinα3沉默番茄果实和importinα3基因编辑番茄植株。研究发现,importinα3沉默番茄果实和基因编辑番茄果实出现提前进入红熟期、叶绿素降解进程加快等现象,番茄果实成熟衰老进程加快。通过RT-q PCR,发现importinα3沉默果实和importinα3缺失果实中叶绿素降解基因（PPH、SGR1、NYC1、PAO）、类胡萝卜素合成基因（PSY、PDS、ZDS）和乙烯通路基因（ACO3、ACO1、ACS2、RIN、E8、E4、NOR）的表达水平上调,这表明importinα3是番茄果实成熟衰老的负调控因子。另外,importinα3缺失导致植株出现番茄植株矮小、果实重量减轻和果实失水加速等现象。为研究importinα3对LCD1细胞核定位的介导作用,以importinα3基因编辑植株和野生型番茄植株作为试验材料,发现LCD1-GFP在野生型番茄叶片中呈现明显的细胞核定位,而在importinα3基因编辑植株叶片中,发现LCD1同时具有细胞核和细胞质定位的现象,表明importinα3对LCD1的细胞核定位具有介导作用。综上所述,LCD1通过影响H2S生成、色素代谢、活性氧积累等途径,进而调控番茄叶片的衰老进程。通过荧光素酶互补实验、巯基化实验以及亚细胞定位实验,发现importinα3通过与LCD1互作,进而介导其进入细胞核,同时importinα3可以响应H2S信号发生巯基化修饰。此外,利用VIGS和基因编辑技术,发现importinα3沉默或缺失导致番茄果实叶绿素降解加快,乙烯合成加速,表明importinα3通过调控乙烯信号转导、色素代谢等途径介导番茄果实成熟衰老进程。