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过氧化氢酶(CAT)参与活性氧代过程,在清除超氧化物阴离子、过氧化氢和过氧化物,阻止或减少羟基自由基(Htydroxyradical)形成等方面发挥着重要作用。
本研究利用无机培养基,从无锡惠山上采集的土样中分离得到一株产胞内CAT活力较高的菌株SYBC-01。经形态学和生理生化初步鉴定为Serratia属,并对其16SrDNA基因序列测定和比对发现,该菌株与SerratiamarcescensDSM30121的16SrDNA基因序列的同源性为99.9%,因此命名为SerratiamarcescensSYBC-01。
对菌株S.marcescensSYBC-01产CAT的摇瓶发酵培养基和发酵条件进行了研究。确定其适宜的发酵培养基组成为(g/L):可溶性淀粉12.5,酵母膏15,磷酸二氢钾0.5,初始pH为8.0。适宜的发酵条件为:种龄为8h,装液量为60mL/250mL,接种量为10%(v/v),摇瓶发酵时间为12h,培养温度为28℃。优化前菌株S.marcescensSYBC-01的CAT酶活为480.20U/mL,优化后其酶活达到1105.58U/mL,提高了1.30倍。
在菌株S.marcescensSYBC-01胞内检测到3个CAT同工酶。本研究将同工酶CAT2作为目标CAT,通过硫酸铵-凝胶过滤层析-离子交换层析三步纯化过程对其分离,最终得到电泳纯酶蛋白,纯化倍数为62.51,酶蛋白得率为32.06%。其天然分子量为140KDa,其分子构型为同源二聚体。经动力学分析确定该酶的表观米氏常数Km为29.7mmol/L,最大反应速度Vmax为80925.79U/mg蛋白。Mg2+和Ca2+对CAT2有激活作用,该酶能被叠氮化物和金属鳌合剂等单功能过氧化氢酶抑制剂抑制,对乙醇和氯仿等有机溶剂有耐受性。在以愈创木酚作为电子供体测定过氧化物酶活性时发现,该酶不显示相应的酶活性。所以CAT2为单功能过氧化氢酶。
纯化后的CAT2的最适pH为7,在pH6-pH10范围内稳定性较好,相对酶活均超过50%。CAT2的最适温度为70℃,该酶的温度稳定性较好,在30℃-60℃范围内分别保温30min和60min,残余酶活均超过70%。