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真核生物的蛋白质合成终止需要两种相互作用的释放因子,第一类肽链释放因子(eukaryotic release factor1, eRF1)和第二类肽链释放因子(eukaryotic release factor3,eRF3)。eRF3是一种GTPase,与eRF1相互作用形成复合体,确保快速有效的肽链释放。进一步研究发现eRF3是一种多功能蛋白质,还参与了细胞周期调控,细胞骨架组装和肿瘤发生等过程。哺乳动物中eRF3有两种,分别为eRF3a和eRF3b,两者的区别在于其N末端结构域有差异。eRF3a有三种转录异构体,异构体1(eRF3a-F1)和2(eRF3a-F2)只有一个氨基酸不同,而异构体3(eRF3a-F3)的N末端却缺失了约140个氨基酸。生存素survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis, IAP)家族的最小成员。该蛋白结构独特,功能多样,在多种人的肿瘤细胞中过表达,并在细胞分裂,细胞内信号以及细胞凋亡等途径中起显著作用,因此倍受关注。eRF3和survivin的功能都与细胞周期调控和肿瘤发生相关,它们是否协同作用参与了这些过程的调控是一个值得探究的问题。本研究利用酵母双杂交和pull down分析证实了人类eRF3a-F3、eRF3b与survivin的相互作用关系,并确定了其相互作用的结构域,还对两者进行了亚细胞共定位分析,为进一步探讨细胞有丝分裂调控机制提供了重要线索。研究的主要结果如下：从人的宫颈癌细胞中克隆获得了survivin cDNA,利用本实验室已构建的重组质粒pcDNA3.0-heRF1和已克隆的人类eRF3a-F3和eRF3b cDNA构建了一系列酵母双杂交重组质粒,将这些质粒分别共转化酵母菌株AH109,经SD-Leu-Trp-His-Ade培养基严谨筛选后,进行β-半乳糖苷酶活性分析,发现表达survivin/eRF3a-F3和survivin/eRF3b的酵母菌均显示蓝色,与阳性对照组(表达eRF1/eRF3a-F3和eRF1/eRF3b)的结果一致,而阴性对照组(只表达survivin、eRF3a-F3和eRF3b)未显示蓝色。结果表明eRF3a-F3和eRF3b均能与survivin相互作用。为了进一步验证eRF3和survivin在体外的作用关系,构建了一系列原核重组表达质粒,并将这些质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达。分别利用GST及Ni-NTA亲和层析纯化GST融合蛋白和His融合蛋白,用于pull down实验。将His-eRF3a-F3表达上清与结合有纯化的GST-hSVV的GS4B介质结合后,洗去杂蛋白,洗脱产物经SDS-PAGE分析后,用抗His的抗体经western blotting进一步鉴定,结果为阳性。另外,将GST-heRF3b表达上清与结合有纯化的His-hSVV的Ni-NTA介质相结合,洗去非特异蛋白后,洗脱产物同样经SDS-PAGE分析并用抗GST的抗体经western blotting进一步鉴定,结果也呈阳性。这说明eRF3a-F3、eRF3b和survivin在体外也能相互作用。木研究还确定了eRF3和survivin相互作用的最小结构域。分别对eRF3a-F3、 eRF3b和survivin进行了截短突变,共构建了7个重组质粒：pGADT7-h eRF3a-F3△1-72、pGADT7-heRF3b△1-201和pGBKT7-hSVV△1-88、PGBKT7-hSVV△1-44、 pGBKT7-hSVV△1-64、pGBKT7-hSVV△1-76、pGBKT7-hSVV△77-142。酵母双杂交结果表明eRF3与survivin的相互作用结构域位于eRF3a-F3的1-72位氨基酸,eRF3b的131-200位氨基酸。而eRF3a-F3的1-72位氨基酸相当于eRF3a-F1的139-210位氨基酸和eRF3b的130-201位氨基酸,说明该区域是两种蛋白质相互作用必需的。结果还表明survivin的65-76位氨基酸是survivin与eRF3相互作用必需的结构域,其中的68EPDDD72可形成一个带负电荷的β折叠。为了研究eRF3和survivin相互作用是否参与细胞内活动的调控,构建了融合绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)的重组表达载体pEGFP-N1-heRF3a-F3、 pEGFP-N1-heRF3b和pDsRed2-N1-hSVV,共转染Hela细胞后,通过激光共聚焦显微镜观察发现过量表达GFP-eRF3a-F3和GFP-eRF3b导致绿色荧光蛋白在细胞核内积累；同时,细胞核内还有RFP-survivin表达的红色荧光蛋白的分布。eRF3和survivin在Hela细胞核的共定位表明两者可能共同参与了细胞核过程的调控。