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目的:肺癌是全世界常见的恶性肿瘤,5年生存率仅10%左右。尽管近年来新的抗癌药物和化疗方案不断推出,但治疗效果仍无显著提高。如何寻找一种有效措施以提高化疗疗效是目前亟待解决的问题。生物化疗(Biochemotherapy)是生物治疗与化疗相结合的方法,与单用化疗相比,有疗效迭加及减轻毒副反应的作用,是目前肿瘤综合治疗新动向之一。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor)属于生物制剂中细胞因子类,而细胞因子类的应用是目前最成熟的生物治疗方法[1]。本实验拟通过动物实验观察重组改构人肿瘤坏死因子(recombinant mutant human tumor necrosis factor,rmhTNF)是否能增强顺氯氨铂(cisplatin,DDP)对小鼠Lewis肺癌的化疗疗效,进一步阐明抗肿瘤血管生成是其增效化疗可能的作用机制之一,同时观察rmhTNF是否有改善免疫功能的作用,初步探讨rmhTNF联合DDP治疗肺癌的可行性。方法:将体重为16~20克健康C57BL/6小鼠(60只)随机分为4组,生理盐水对照组(对照组,15只),rmhTN- F单药组(15只),DDP单药组(15只),DDP+rmhTNF联合组(联合组,15只)。然后将小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞株接种于各组小鼠右上肢腋窝皮下,构建动物实验模型[2]。随后隔日检查皮下肿瘤生长情况。接种第5天,约半数能扪及肿瘤,第7天,都能扪及肿瘤,待第12天,扪及皮下肿瘤平均大小约(1.0×1.0×1.0)cm3时开始进行瘤内注药[3、4]。对照组瘤内注射生理盐水0.2mL/只,rmhTNF单药组瘤内注射rmhTNF 0.2mL/只(150万IU/kg),DDP单药组瘤内注射DDP 0.2mL/只(6.15mg/kg),联合组瘤内注射DDP(6.15mg /kg)和rmhTNF (150万IU/kg)各0.2mL/只。以上四组每天给药一次,连续3天[5],给药第一天开始观察小鼠的生活状态。末次给药后24小时集体脱颈处死小鼠,立即完整剥离肿瘤组织,称取并记录每个瘤体的重量(g)及小鼠去肿瘤后重量(g),测量并计算每个肿瘤体积(mm3),各组肿瘤抑制率,同时取瘤组织,通过逆转录-聚合酶链反应(revers transcription PCR,RT-PCR)半定量检测低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)mRNA的表达水平。应用免疫组织化学(immunohistoche- mistry,IHC)方法定性观察血管内皮生长因子(vascular endot- helial growth factor,VEGF)及其受体(vascular endothelial gro- wth factor receptor-2,VEGFR-2/KDR)蛋白的表达情况。采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)半定量检测基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)蛋白的表达水平。结果:1小鼠生活状态、最终去瘤体重:各治疗组小鼠均有轻到中度的脱毛,食欲下降,活动迟缓,精神萎靡,rmhTNF单药组生活状态最佳,联合组较DDP单药组生活状态好。rmhTNF组的小鼠最终去瘤体重高于对照组(P<0.05),其他治疗组小鼠最终去瘤体重与对照组相比均有下降(P<0.05),联合组小鼠的最终去瘤体重高于DDP组(P<0.05)。2瘤重、体积、抑瘤率:单药组平均肿瘤体积和平均瘤重均低于对照组(P<0.05);联合组的肿瘤体积、平均瘤重低于各单药组(P<0.05),抑瘤率高于各单药组(P<0.05)。两单药组之间无明显差异(P>0.05)。3半定量RT-PCR检测HIF-1αmRNA结果:两单药组的HIF-1αmRNA表达水平较对照组明显下降(P<0.05),联合组的表达水平明显低于两单药组(P<0.05),两单药组之间无明显差异(P>0.05)。4免疫组化检测VEGF、KDR蛋白表达结果:两单药组VEGF、KDR表达均低于对照组(P<0.05),联合组VEGF、KDR表达均低于各单药组(P<0.05),两单药组表达水平之间无显著差异(P>0.05)。5 VEGF和KDR蛋白表达相关性检测结果:免疫组化结果显示小鼠Lewis肺癌组织的对照组、rmhTNF组、DDP组和联合组的VEGF和KDR蛋白表达均具有正相关性,r值分别为0.703,0.538,0.644,0.608,P值分别为0.003,0.039,0.010,0.016。6流式细胞术检测MMP-2结果:单药组的MMP-2表达水平较对照组明显下降(P<0.05),联合组的表达水平明显低于两单药组(P<0.05),两单药组之间无明显差异(P>0.05)。结论:1 rmhTNF和DDP单用对小鼠Lewis肺癌均有抗瘤特性,而两药联合作用明显增强,rmhTNF能够增强DDP对小鼠Lewis肺癌的抑制作用,并能改善小鼠的免疫功能。2 rmhTNF和DDP单用均能抗肿瘤血管生成,而联合应用其抗肿瘤血管生成作用更加显著,进一步反映rmhTNF可能通过抗肿瘤血管生成的机制增强化疗疗效。3 rmhTNF、DDP可能通过基因水平上对HIF-1α的抑制,导致HIF-1α蛋白水平的表达降低,从而降低VEGF蛋白的表达,进一步影响KDR蛋白的表达;同时也可以抑制MMP-2蛋白的表达,从而抑制肿瘤血管生成,最终达到抗肿瘤的作用。4小鼠Lewis肺癌中有HIF-1αmRNA、VEGF、KDR和MMP-2的表达,且VEGF和KDR的表达有明显的正相关性。5本实验为rmhTNF和化疗药物联合应用治疗肺癌以提高疗效提供了理论依据,为肺癌的综合治疗提供了新的选择。