骨骼肌组织工程的建立为各种骨骼肌病(肌营养不良、脊髓性肌萎缩等)提供了治疗希望,也为整形外科治疗创伤、肿瘤切除、失神经支配所致的肌组织缺失所期盼。尽管组织工程研究已经取得显著的进步,许多人工组织,包括皮肤、骨骼、软骨已经进入临床,但骨骼肌组织工程研究却因其在高密度的细胞增殖分化、三维极性培养、较大体积的肌组织构建等方面的困难而面临挑战。然而,许多学者仍致力于骨骼肌的体外构建和替代研究,试图创建功能化的肌组织。经过多年的探索和努力,一些权威的研究组取得了相当的成绩,不断推进骨骼肌组织工程的研究进展:Powell等采用胶原和基质成功构建三维骨骼肌组织,并对构建组织施加机械刺激,确保体外培养肌组织的形成、分化和收缩功能形成;Dennis和Kosnik则探索出三维骨骼肌组织的自组装模式,作者称其构建肌组织为Myooids,在横向电刺激时具有持续的兴奋性和收缩功能。德国的Bach研究组进行了成肌细胞与纤维蛋白三维支架的复合培养,获得了具有极性分化功能的多核肌管。骨骼肌组织体外构建的关键技术是以成体骨骼肌卫星细胞或成肌细胞系为目标细胞,体外大量扩增后植入不同的三维基质材料,使其生长分化形成具有一定形状、收缩能力、能较长期存活的体外骨骼肌组织类似物。为实现真正意义的体外骨骼肌组织构建,国外学者在完善肌组织构建技术的同时,也对体外分化并与不同基质材料复合的肌组织中关键调节分子的表达进行了系统的检测(如生肌转录因子、收缩蛋白、肌肉肌酸激酶、乙酰胆碱受体等),多角度探讨体外构建肌组织的发生、分化、相应特殊转录因子的表达和控制发生的信号系统是否与体内的骨骼肌成肌细胞的发生、分化步骤相吻合。上述骨骼肌组织构建和研究的成果,为今后的骨骼肌组织工程研究者提供了线索和思路。我们对国、内外有关骨骼肌组织构建研究资料的分析发现,尽管目前尚难以体外成功构建能够模仿体内骨骼肌特性和功能的较大体积的肌组织结构,但现有的、以及正在探索的体外肌组织构建物却能够模仿体内肌组织的分化和发育,表达收缩蛋白并具备收缩效应,且避免了其他细胞或组织成分的干扰,是进行骨骼肌发生发育以及骨骼肌肌病研究的理想体外模型。但目前国内尚无成功构建体外三维肌组织的报道。Sylgard 184属于硅酮橡胶弹性材料,其双组分混合固化后,表面光滑并具有一定的弹性,具有柔性基底层特征,便于检测细胞移动和加载产生的牵拉力。因此,作为细胞应力拉伸材料,Sylgard184在细胞力学检测和骨骼肌组织工程领域得到广泛应用,学者们多以此材料为培养基质进行骨骼肌组织的体外构建。鉴于上述研究背景,本研究考虑以Sylgard 184(硅酮弹性材料)作为生长支架,与成肌细胞进行体外复合培养,探讨体外构建三维骨骼肌组织模型的可行性。由于支架材料与种子细胞的良好接触决定细胞的增殖、分化及功能表达,我们首先选用不同的细胞基质成分(胶原、层粘连蛋白等)对Sylgard 184进行表面包被修饰,分析成肌细胞在不同基质材料修饰的Sylgard 184表层的生长、分化特性,筛选最佳的表面修饰成分;由于体外构建三维肌组织的关键在于极性平行分化肌管的出现及维持,本研究进一步对优化修饰的Sylgard 184进行压痕铸型处理,通过铸槽的引导作用,以及Matrigel基质的促生长和促延展性能,获取极性平行分化的肌组织,并对极性肌组织的成肌特性、收缩功能进行分析检测,为成功构建三维的体外肌组织模型奠定基础。本文内容结构第一章不同基质材料修饰的Sylgard 184与C2C12细胞的相容性研究[目的]筛选理想的Sylgard 184表面修饰的基质材料,以提高材料表层与C2C12成肌细胞的生物相容性。[方法]Sylgard 184双组分以10:1的比例均匀混合,倒入6孔板的其中4孔,室温下静置固化,其余2孔做为空白对照培养组(A组);固化后的Sylgard 184表面依次经过以下处理:Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)包被(B组)、层粘连蛋白(Laminin)包被(C组)、多聚赖氨酸(poly-lysine)包被(D组);未经包被(E组),每组共6个样本。利用倒置显微镜观察各组C2C12细胞的生长状态,流式细胞术(FlowCytometry,FCM)检测增殖培养48h后C2C12细胞的分裂增殖情况,RT-PCR检测增殖和分化培养48h后细胞内MyoD、Myogenin基因mRNA的表达。[结果]Sylgard 184材料存在细胞毒性,E组接种的C2C12细胞在24h内全部漂浮死亡;D组的大多数细胞出现死亡,仅少数贴壁存活;而B、C两组材料包被后明显减少Sylagard 184的毒性,增强其表面与C2C12细胞的相容性,此外,C组细胞处于合成期的百分比以及MyoD和Myogenin基因mRNA的表达水平均显著高于A、B二组(P<0.05)。[结论]经层粘连蛋白包被修饰的Sylgard 184生物相容性最佳,有利于C2C12细胞的生长、增殖及分化。第二章三维极性分化肌组织的体外构建和检测[目的]利用修饰并铸型后的Sylgard 184与C2C12细胞复合培养、诱导分化获取三维极性分化肌管,检测分化肌管的生长和功能特性。[方法]Sylgard 184双组分以10:1的比例均匀混合,倒入6孔板中,室温下静置固化,对固化的Sylgard 184表面压痕铸型(每个小的铸型凹槽宽0.8mm、深度0.15mm、长度根据需要可调整),置生物安全柜,用Hank’s液冲洗凹槽,Matrigel和胶原(混合比例1:6)混合液均匀铺被凹槽底部,每个凹槽加入混合液0.3ml,放置生物安全柜,确保细胞基质材料的均匀覆盖,紫外消毒,接种密度为1.0～1.2×10~5/ml的C2C12细胞悬液,增殖培养48h后,待细胞增殖约80%融合时撤除全培培养基,加入含2%马血清的DMEM/F12分化培养7d后,倒置显微镜形态学观察摄片,继续分化至21d后,对所构建的骨骼肌组织进行免疫荧光检测生肌转录因子和成肌特异蛋白的表达,RT-PCR方法检测Myogenin、Desmin基因mRNAs的表达,同时采用扫描电镜观察肌管形态和肌管间的连接。[结果]C2C12细胞在Sylgard 184弹性体铸型压槽中培养,诱导分化7d后,倒置显微镜下观察可见肌管呈极性分化,肌管之间相互融合;继续分化到21d后,对分化形成的肌组织做扫描电镜检测,可见肌管之间排列紧密且相互重叠,形成膜样结构,厚度可达0.15mm,具有三维性;对肌管重叠构成的骨骼肌组织进行RT-PCR检测证实Myogenin、Desmin基因mRNAs的阳性表达,免疫荧光检测以及DAPI核染,进一步验证极性肌管内分化特异性标志蛋白Myogenin及收缩蛋白Desmin的表达:Myogenin阳性核染大量出现于分化肌管;骨骼肌细胞骨架蛋白Desmin是特异性中间纤维蛋白,主要分布在胞浆,是肌细胞骨架的主要成份,也是骨骼肌最早的成肌标志之一,其阳性表达证实肌组织构建物的成肌特征以及极性肌管的形成。[结论]修饰并铸型的Sylgard 184凹槽具有一定的方向引导效应,能促进C2C12细胞分化形成多核肌管,肌管呈极性重叠排列并构成三维骨骼肌组织。