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哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin，mTOR)能够调节细胞的生长。mTOR能够组成两种功能复合物:mTORC1和mTORC2，其中mTORC1能够通过其上游多种“感受器”感受细胞内外的一系列信号变化，包括能量状态、生长因子和激素、营养因子等，来调节细胞内蛋白质合成和降解，从而调控细胞生长。营养因子中，氨基酸既是蛋白质合成的必需底物，也是mTORC1活性调节的必要的信号分子。在氨基酸中，亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸被认为能有效调节mTORC1活性。且氨基酸转运感受体参与氨基酸依赖性的mTOR活性调节过程。 近几年研究发现一种G蛋白偶联受体T1R1/T1R3(Taste Receptor Type1subtype1/3，T1R1/T1R3)能够作为广谱性的氨基酸感受体感应胞外氨基酸，通过促进胞内Ca2+增加激活ERK1/2来参与调控mTOR。然而目前研究主要针对胞外总的氨基酸，究竟哪些氨基酸参与该过程并不清楚，因此T1R1/T1R3介导调控mTOR信号是否具有氨基酸特异性及其调控机制有待进一步阐明。 本课题研究内容由两部分组成，本实验以C2C12小鼠成肌细胞作为研究对象，第一部分在确定T1R1/T1R3对mTOR信号具有调控作用的基础上，筛选由T1R1/T1R3介导的调控mTOR信号的胞外氨基酸。第二部分进一步探索T1R1/T1R3参与氨基酸依赖性的mTOR活性调节的机制及其特异性。 第一部分主要结果如下: 1、Q-PCR方法测定2％马血清诱导的C2C12细胞分化0、2、4、8天，T1R1/T1R3的表达情况。研究发现T1R1/T1R3在小鼠C2C12成肌细胞诱导分化过程中有表达。 2、C2C12成肌细胞中T1R1/T1R3能介导氨基酸调控mTOR信号。在有氨基酸存在的情况下，利用信号通路抑制剂及激动剂处理细胞，Western blot方法测定p-S6K1、p-mTOR磷酸化水平的变化，鉴定T1R1/T1R3对蛋白质合成的作用，并筛选出最佳抑制剂浓度。研究发现Ca2+螯合剂BAPTA-AM及ERK1/2活性抑制剂U0126都能极显著抑制氨基酸诱导的mTORC1的激活(P＜0.01)，且具有浓度依赖性效应。T1R1对氨基酸的特异性增强剂IMP预处理细胞则能显著增加氨基酸诱导的mTORC1的激活(P＜0.05)。并且BAPTA-AM浓度为10μmol/L，U0126浓度为15μmol/L，即能达到极显著抑制效果。说明C2C12成肌细胞内T1R1/T1R3也能介导氨基酸通过促进胞内Ca2+升高及激活ERK1/2来参与调控mTOR信号。 3、蛋氨酸参与T1R1/T1R3介导调控蛋白质合成。不同氨基酸处理细胞后，Western blot方法测定p-S6K1、p-mTOR磷酸化水平的变化、SUnSET非放射性方法检测蛋白质合成速率、Q-PCR检测蛋白质降解标志基因，筛选出参与T1R1/T1R3介导的调控mTOR信号的胞外氨基酸。研究发现七种能引起胞内Ca2+增加的氨基酸(50mmol/L)中只有蛋氨酸能极显著激活mTORC1(P＜0.01)，蛋氨酸能极显著促进蛋白质合成速率，该过程依赖于mTOR，并且能极显著抑制蛋白质降解途径关键基因Atrogin-1、MuRF-1的mRNA表达水平(P＜0.01)。说明参与T1R1/T1R3介导的调控mTOR信号的胞外氨基酸主要为蛋氨酸，表明蛋氨酸可能成为研究氨基酸受体T1R1/T1R3介导调控mTOR信号的主要氨基酸。 第二部分主要结果如下: 1、蛋氨酸能被T1R1/T1R3介导通过促进胞内Ca2+增加激活ERK1/2，从而调控mTOR活性。在有蛋氨酸诱导的情况下，利用信号通路抑制剂及激动剂处理，Fluo-8检测胞内Ca2+变化，Western blot方法测定p-S6K1、p-mTOR磷酸化水平的变化、SUnSET非放射性方法检测蛋白质合成速率，验证C2C12成肌细胞中蛋氨酸调控mTOR信号的分子机制。研究发现Met能促进胞内Ca2+增加，Ca2+螯合剂BAPTA-AM、PLC特异性抑制剂U73122、ERK1/2活性抑制剂U0126都能极显著抑制蛋氨酸诱导的mTORC1的激活(P＜0.01)，T1R1/T1R3对氨基酸的特异性增强剂IMP则能显著增加蛋氨酸诱导的mTORC1的激活(P＜0.05)。说明蛋氨酸能激活mTORC1，且蛋氨酸调控mTOR依赖于T1R1/T1R3-PLC-Ca2+-ERK1/2信号转导途径。 2、ERK1/2在T1R1/T1R3介导氨基酸调控mTOR中具有一定作用。Western blot检测通路关键蛋白p-ERK1/2的水平，验证ERK1/2活性对蛋氨酸调控mTOR的重要性。研究发现BAPTA-AM处理能极显著增加蛋氨酸引起的p-ERK1/2水平(P＜0.01)，且具有浓度依赖性效应，与p-S6K1变化水平相反。IMP处理则能抑制蛋氨酸引起的p-ERK1/2水平，U0126处理抑制ERK1/2活性则能抑制蛋氨酸引起的p-ERK1/2水平。 3、T1R1/T1R3介导氨基酸调控mTOR信号具有氨基酸特异性。利用不同类型氨基酸处理细胞，Western blot检测通路关键蛋白水平的变化，探索T1R1/T1R3介导氨基酸激活mTORC1的氨基酸特异性。研究发现蛋氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸及丙氨酸五种氨基酸处理细胞，随着氨基酸浓度增加，蛋氨酸及亮氨酸能诱导通路关键蛋白的水平逐渐增加，而谷氨酰胺、甘氨酸及丙氨酸诱导则无显著变化。亮氨酸激活mTORC1也依赖于胞内Ca2+及ERK1/2。证实T1R1/T1R3调控mTOR信号的主要是蛋氨酸，其他氨基酸效果不显著。 综上所述，本研究的结论是: 1、参与C2C12成肌细胞T1R1/T1R3介导的调控mTOR信号的胞外氨基酸主要为蛋氨酸。 2、蛋氨酸激活mTORC1依赖于T1R1/T1R3-PLC-Ca2+-ERK1/2信号转导途径。T1R1/T1R3介导氨基酸通过T1R1/T1R3-PLC-C-Ca2+-ERK1/2信号转导途径调控mTOR具有氨基酸特异性。